高效溶磷菌的筛选、鉴定及其溶磷特性

邵锴++邱业先++徐婧

摘要：为了从根际土壤中筛选出具有较高溶磷能力的菌株及优化溶磷条件，通过种子萌发初步研究溶磷促生效应。通过稀释涂布法分离、筛选菌株，并进行ATB细菌鉴定仪及16S rDNA测序鉴定；采用单因子试验及正交试验优化菌株溶磷发酵条件，利用种子发芽指标测定菌株的促生能力。结果显示，筛选出菌株BD-1的溶磷能力最强，经ATB细菌鉴定仪及16S rDNA测序，该菌株被鉴定为路德维希肠杆菌。正交试验结果表明，在温度为30 ℃、摇床转速为180 r/min、接种量为2 mL、初始pH值为7.0的条件下培养7 d的溶磷效果最好，其溶磷量为181.73 g/L。种子萌发试验结果表明，该溶磷菌对作物种子萌发具有一定的促进作用。

关键词：溶磷菌；微生物肥料；条件优化；解磷能力；种子萌发；鉴定；筛选；溶磷特性

中图分类号： S154.38+1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0253-04

磷是植物生长必需的营养元素之一，植物的光合作用和体内的生化过程都必需有磷参与[1-2]，但其在土壤中主要以难溶性矿物态存在[3]，难溶性矿物态磷无法被作物直接吸收利用。为提高作物产量，超过90 kg/hm2磷肥被施用于土壤中[4]，部分磷肥被作物吸收利用，大部分被转化成难溶性磷返施于土壤。大量化学磷肥的施用，伴随土壤板结、土壤酸化、土壤贫瘠化日益严重。因此，提高土壤中磷的利用效率对降低化学磷肥的施用量具有十分重要的意义。土壤中存在大量的微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用形态，具有这种能力的微生物称为解磷菌或溶磷菌[5]。溶磷微生物作为微生物肥料的开发和利用已经成为人们关注的焦点。土壤中存在的溶磷微生物能够通过自身生长代谢，转化难溶性磷为可溶性磷，促使作物吸收利用。但是，微生物仅能够溶解难溶性磷，还不能被认为就是溶磷菌，溶磷菌还须考虑作物促生效应[6]。目前，有关农作物溶磷微生物的分离和应用也有一定的研究。李倩利用蒙金娜无机溶磷培养基从桂花树根际黏附土壤中分离筛选出1株高效溶磷菌株，为洋葱伯克霍尔德氏菌，并测得其溶磷量为 503.53 μg/mL[7]。刘文干等从花生根际土壤样品中筛选到1株溶磷能力强的菌株黑曲霉，溶磷量达到177.4 mg/L[8]。因此，合理利用溶磷微生物与开发微生物肥料对提高作物产量、减少化学肥料使用、降低环境土壤污染具有巨大前景[9-10]。大多数学者从单一磷源中筛选溶磷菌，而进行多种磷源筛选溶磷菌、提高溶磷菌的质量与特性就尤为重要。本研究以采自作物的根际土壤为研究对象，分离、筛选出溶磷细菌，通过ATB细菌鉴定仪及16S rDNA测序鉴定出溶磷细菌，研究高效溶磷菌的溶磷效果，运用单因素试验和正交试验[11-12]对溶磷菌的溶磷效果进行优化，并通过种子萌发进行溶磷促生初步效果验证，为溶磷菌菌剂开发微生物肥料打下基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1土壤来源于2015年4月15日采集江苏省扬州市江都区双沟陈甸果园里长势良好的扁豆、韭菜、红薯、毛豆等作物的根际土壤。土样采集后放置于无菌袋中，于实验室 4 ℃ 冰箱内保存。

1.1.2培养基有机磷筛选培养基：葡萄糖10 g、CaCO3 5 g、（NH4）2SO4 0.5 g、MgSO4 0.3 g、FeSO4 0.3 g、KCl 0.3 g、NaCl 0.3 g、卵磷脂0.2 g、MnSO4 0.03 g，无菌水1 000 mL，pH值 7.0～7.2；LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，无菌水1 000 mL。

1.2方法

1.2.1溶磷细菌的筛选

1.2.1.1溶磷细菌的分离称取5 g土样加入45 mL无菌水，于28 ℃、180 r/min下振荡0.5 h，充分混匀，制成10-1浓度梯度，按10倍稀释法制备成10-3、10-4、10-5、10-6 各梯度土样悬液，各梯度吸取100 μL土样悬液均匀涂布在有机磷培养基上，每个梯度设3组重复。倒置平板于28 ℃恒温培养箱中培养4 d，用无菌的牙签挑取菌落，并通过划线分离纯化得到单菌落，保存于LB斜面培养基中，4 ℃冰箱保存。

1.2.1.2溶磷细菌的筛选（1）将斜面保存的菌种用无菌牙签挑取出来转接于固体培养基上，倒置平板于28 ℃恒温培养箱中培养4 d，用游标卡尺测量菌落的直径（d）和透明圈的直径（D），用D/d表征溶磷菌的溶磷能力以作为初筛。（2）将初筛得到的菌种用无菌生理盐水制备成相应浓度菌悬液，于150 r/min、28 ℃下培养5 d，以接无菌水的摇瓶作对照。培养物转移至无菌的50 mL离心管中，采用超声波破碎，处理时间为20 min，使之释放出细胞内的有效磷。以4 000 r/min的转速进行离心20 min，留上清液待测，参考张祥胜的钼锑抗比色法测上清中有效磷含量[13]。

1.2.1.3溶磷细菌对不同磷源的溶磷效果将有机磷的磷源依次替换成等量的磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝，通过上述钼锑抗比色法测量溶磷细菌对不同磷源的溶磷效果。

1.2.2溶磷细菌的鉴定

1.2.2.1ATB细菌的鉴定参照ATB细菌鉴定手册对溶磷细菌进行鉴定。

1.2.2.216S rDNA测序分离得到的溶磷细菌BD-1用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA并进行PCR扩增。PCR所用引物为：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系：Taq PCR Master Mix 25 μL、DNA template 1 μL、Primer F 2 μL、Primer R 2 μL、Nuclease-free ddH2O 20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min，循环 30次；72 ℃ 5 min。PCR產物经琼脂糖凝胶电泳检测后用试剂盒纯化，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果输入到NCBI数据库中进行BLAST比对，通过CLUSTAL X进行多重序列比对，将比对结果转换为MEGA格式，输入到MEGA 5构建系统发育树探讨目的菌株的亲缘性。

1.2.3溶磷菌溶磷条件优化采用正交设计对溶磷效果进行优化，根据溶磷细菌溶磷效果响应时间变化，主要考虑温度、转速、接种量、初始pH值对溶磷效果的影响，采用4因素3水平进行L9（34）正交试验，3组重复，正交试验设计见表1。

1.2.4种子发芽指标的测定根据优化结果培养溶磷菌制备菌悬液，挑选颗粒饱满的白菜苏州青种子，先用70%乙醇消毒，再用0.1% HgCl2浸泡1 min，无菌水清洗3次，放入预先灭菌好的培养皿中，每皿50粒，无菌注入稀释10倍的上述菌悬液10 mL，无菌水处理为对照（CK），于25 ℃恒温培养 7 d。根据发芽试验期间的记录，计算各项发芽指标：发芽势（GE）=前3 d发芽种子数/种子总数×100%；发芽率（GP）=7 d发芽种子数/种子总数×100%；发芽指数（GI）=Gt/Dt（Gt指在t d内的发芽数，Dt为相应的发芽时间）；活力指数（VI）=Gt/Dt×幼苗生长势；幼苗生长势=预选时间内供试种子平均芽长+平均根长（芽长为发芽7 d量取的幼苗芽长；根长为发芽7 d量取的幼苗根长）。

2结果与分析

2.1溶磷细菌的筛选

本研究筛选到有透明圈的菌株为43株，发现透明圈D/d的值与摇瓶复筛并不成线性比列，与许多学者研究结果一样，所以以摇瓶复筛选取10株D值较大菌株结合不同磷源的液体摇瓶复筛，结果见表2，其中MD-8在初始卵磷脂摇瓶筛选中溶磷量最大，对其他3种磷源溶解效果不是很明显，而BD-1在不同磷源下的水溶性磷都比较大，所以BD-1被选作进一步研究的菌株。

2.2溶磷细菌的鉴定

2.2.1ATB细菌鉴定结果ATB细菌鉴定仪测定的生化反应谱如表3所示，鉴定结果为肠杆菌属菌株。

2.2.216S rDNA测序结果根据16S rDNA测序与NCBI数据库BLAST比对的结果，对溶磷菌BD-1与参比菌株构建系统发育树。从图1可看出，BD-1与菌株路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）处于同一分支，亲缘关系较近，且同源性高达99%，NCBI数据库登录号为NR 042349.1，所以菌株

暂鉴定为路德维希肠杆菌。

2.3培养条件的单因素试验结果

从图2可以看出，培养基初始pH值对培养基中水溶性磷影响较大，在pH值为7～8的条件下溶磷效果较好；在摇床转速120～160 r/min下，培养基中溶磷量较高，并在 150 r/min 下达到最佳溶磷效果；随着温度升高，培养基中溶磷量先增后减，在30 ℃下溶磷效果最好，所以确定最佳温度为30 ℃；随着接种量的增加，培养基中溶磷量也是先增后减，在2.0～2.5 mL下达到稳定。

由图3 可以看出，溶磷菌随着培养时间的延长，培养基中溶磷量先缓慢增加，在培养后7 d达到最大值，随后出现下降趋势，这主要是因为随着培养时间的延长，培养基中的营养物质逐步减少，同时微生物代谢副产物出现累积，导致微生物活性下降，从而使培养基中溶磷量下降。因此，最佳发酵时间为7 d。

2.4正交试验结果

为了优化溶磷菌的培养条件，根据以上单因素试验，进行正交试验，所得结果见表3。综合正交试验的k值和极差R大小，影响供试菌BD-1溶磷量的主次顺序为A>B>C>D，即温度>转速>接种量>初始pH值，且最优水平为A2B3C2D2，即温度30 ℃、转速180 r/min、接种量2 mL、初始pH值7.0。针对该条件进行验证试验，发酵时间为7 d，溶磷量为 181.73 mg/L。证明通过正交试验优化，调整后的培养条件有利于供试菌BD-1的溶磷效果。

2.5种子发芽结果

从表4、图4可以看出，BD-1溶磷菌具有一定的促生效

应。溶磷菌液能分别提高发芽势、发芽率、发芽指数4百分点、8百分点、5.35，促进种子萌发周期，提高作物种子利用效率，说明溶磷菌液对作物根系有促生作用。

3讨论与结论

本试验从作物根际土壤中成功分离筛选到1株耐受不同

磷源的广谱性磷细菌，通过ATB细菌鉴定仪及16S rDNA测序初步鉴定为路德维希肠杆菌。路德维希肠杆菌溶磷效果少有报道，龚凤娟等从杜仲中分离到路德维希肠杆菌，发现它具有1-羧基-1-氨基环丙烷（1-aminocy-clop ropane-1-carboxylate，ACC）脱氨酶活性[14]；王西祥等分离得到的路德维希肠杆菌产吲哚乙酸量达148.80 mg/L[15]；王金昌等成功分离筛选到的路德维希肠杆菌既能解钾又能解磷，还能促进蕹菜的生长[16]；Shoebitz等从多年生黑麦草根际筛选到路德维希肠杆菌，并从固氮酶活性、溶磷特性、IAA分泌以及相关促生长试验中证实此菌株具有PGRP特性[17]；Walpola筛选出抗杀菌剂的路德维希肠杆菌，并且具有一定的溶磷效果，为生物接种剂提供理论指导[18]；王舒等分离得到的路德维希肠杆菌在NBRIP液体培养基中培养4 d的有效磷含量达 401.56 mg/L[19]。本研究分离得到的菌株BD-1解磷能力稍弱，但本研究以不同磷源作筛选培养基筛选到的菌株具有溶解多种难溶性磷酸盐的作用，进而能提高溶磷菌株的溶磷宽度。

有关细菌溶磷条件的优化早有研究，多数从碳源、氮源、pH值、温度、转速、接种量、装液量等方面进行研究[20-21]。本研究通过初始pH值、接种量、温度、转速这4个因素进行路德维希肠杆菌BD-1溶磷条件的正交优化，并根据溶磷效果相应时间的变化，证明在溫度30 ℃、转速180 r/min、接种量 2 mL、初始pH值7.0的条件下发酵7 d时，发酵液中的溶磷量最高，达到181.73 mg/L ，然而这种溶磷优化条件还只是试验性的，要真正应用到微生物肥料工业化生产中还须要进一步生产工艺研究。

该试验从种子萌发对溶磷菌促生效应进行初步研究，通过种子萌发试验证明BD-1溶磷菌在发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数等方面对作物有一定的促生效应，较对照组分别提高5.56%、10.26%、7.54%、13.22%，具有一定的研发价值。

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