对节白蜡树叶中挥发性成分提取、GC-MS分析及杀菌活性研究

张良菊，徐慧慧，徐志红，李俊凯，吴清来

(长江大学 农学院，湖北 荆州 434025)

对节白蜡树叶中挥发性成分提取、GC-MS分析及杀菌活性研究

张良菊，徐慧慧，徐志红，李俊凯，吴清来*

(长江大学 农学院，湖北 荆州 434025)

为明确对节白蜡的抗病原因，以开发新的生物农药，采用同时蒸馏萃取法分离提取对节白蜡树叶中的挥发性物质，并对萃取溶剂、温度和时间等条件进行了筛选。结果表明，最佳萃取溶剂为乙醚，最佳萃取温度为100 ℃，最佳萃取时间为6 h。对乙醚提取物进行杀菌活性测试发现，乙醚提取物在500 g/mL的质量浓度下对5种供试病原菌都有一定的杀菌活性，其中对水稻纹枯病菌的杀菌活性最好，抑制率可达100%，其对小麦赤霉病菌的抑制率也能达到55.8%。GC-MS分析结果显示，乙醚提取的挥发性物质主要含有5个可分辨的成分，其中4号成分含量占总提取物的87.00%，NIST11谱库检索确证其结构为邻苯二甲酸二丁酯。根据以上结果，初步确定邻苯二甲酸二丁酯是对节白蜡重要的抗菌成分之一。

对节白蜡； 同时蒸馏萃取法； 提取物； GC-MS分析； 杀菌活性； 生物农药

对节白蜡(Fraxinushupehensis)，又名湖北梣、湖北白蜡、对节树、望乡树[1-2]，是湖北农学院苏丕林教授于1975年首次发现的白蜡属新种[1-3]，发现之初，其仅分布于湖北省钟祥京山大洪山南麓山丘地带。对节白蜡是我国二级珍稀保护植物[4-5]，具有很高的应用价值[6]：树皮作为中药秦皮的来源之一，具有重要的药用价值[7-8]；对节白蜡作为世界仅存的木犀白蜡名贵树种，是世界景点、盆景、根雕家族的极品[9]，其中对节白蜡盆景被誉为“活化石”或“盆景之王”[9]。

特别引起人们注意的是，对节白蜡鲜有虫害，蚜虫、螨虫、线虫、红蜘蛛等均不会对其造成危害。仅是嫩芽刚出时，芽梢可能偶受病虫影响，数天后芽叶老化，影响会自动消除，白粉病、立枯病等均不对其造成危害[10]。分析认为，对节白蜡很有可能自身产生抗虫、抗病的活性物质，帮助其免于病虫害的危害。而目前有关对节白蜡抗虫抗病方面的研究尚属空白。为了明确对节白蜡的抗病原因，采用同时蒸馏萃取法(SDE)针对对节白蜡树叶中的挥发性成分进行提取，采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对提取物进行定性和相对定量分析，并对提取物进行了室内杀菌活性试验，以期发现或开发出一种新型防治病害的生物农药。

1 材料和方法

1.1 材料

对节白蜡树叶：2016年9月采自长江大学农学院园艺盆景园，室温阴干备用。

仪器及耗材：Agilent 7890A/5977B气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)、NIST11质谱谱库(美国安捷伦公司)、同时蒸馏萃取仪(上海昕沪实验设备有限公司)、DF-101S 型多功能集热式磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)、T-403 电子天平(感量0.001 g，美国 Denver公司)、有机相滤膜(孔径0.45 μm)、2 mL一次性注射器。

试剂：提取溶剂石油醚、氯仿、乙醚和提取物配制所用溶剂乙醇均为市售的化学纯试剂，水为娃哈哈纯净水。

1.2 供试病原菌

水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum) 、马铃薯早疫病菌(Alternariasolani)、核桃根腐病菌(Fusariumspp.)、油菜菌核病菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary]菌种由长江大学农学院植物保护教研组提供。

1.3 试验方法

1.3.1 提取物的制备 采用同时蒸馏萃取装置提取挥发性物质[11-12]。将阴干的对节白蜡树叶低温粉碎，准确称取50.0 g样品，放入500 mL的圆底烧瓶中，加入200 mL纯净水和少量玻璃珠，于250 mL接收瓶中加入50 mL萃取溶剂，加热回流提取6 h。收集有机相，加入适量无水硫酸钠干燥30 min，过滤，滤饼用少量溶剂淋洗2～3遍，合并滤液，经旋转蒸发仪浓缩近干，冷冻干燥至恒质量，得挥发性提取物。取0.05 g提取物，加1 mL色谱纯乙腈溶解，用0.45 μm滤膜过滤至1 mL样品瓶中，待GC-MS分析。提取过程中考察了不同萃取溶剂(石油醚、二氯甲烷和乙醚)的萃取效果，及提取温度(80 ℃和100 ℃)和提取时间(3 h、6 h和9 h)的影响。

1.3.2 GC-MS分析条件 GC条件:HP-INNO-Wax 弹性石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；色谱柱初始温度40 ℃保持2 min，以6 ℃/min升温至120 ℃保持2 min，之后以 4 ℃/min升至180 ℃保持2 min，最后以10 ℃/min升温至280 ℃保持2 min；进样口温度为250 ℃，载气为99.999%的氦气，载气流量为1.0 mL/min；采用不分流模式。

MS条件:采用EI源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，MS四极杆温度150 ℃，传输线温度280 ℃，质量扫描范围 50～400 amu。

1.3.3 药液的配制 将对节白蜡树叶提取物用无水乙醇溶解，用含0.1%吐温80的水稀释至500 μg/mL，其中无水乙醇体积分数为5%，然后再将其分别稀释至250、100 μg/mL。

1.3.4 药液对供试病菌的室内活性测定 采用离体平皿法[13]，以5种供试病原菌为对象，对对节白蜡树叶提取物进行杀菌活性测定。将配制好的药液各取1 mL于已灭菌的培养皿中，再取冷却到45 ℃左右的PDA培养基9 mL倒入培养皿，充分混匀，待平板凝固。然后用打孔器切取菌饼，菌面向下接于含毒培养基中心，每皿1块，放入28 ℃恒温箱中，培养2 d后测量菌落直径，每个样品重复3次，以加入无菌水的培养基为对照，通过以下公式计算抑制率。抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

2 结果与分析

2.1 不同极性溶剂对对节白蜡树叶中挥发性物质的提取效率

选用极性从低到高的3种不同溶剂(石油醚、二氯甲烷和乙醚)分别作为萃取溶剂，对对节白蜡树叶中挥发性物质进行提取，用旋转蒸发仪减压浓缩近干后，冷冻干燥至恒质量，计算得出不同极性溶剂的提取效率，如表1所示。由表1可见，不同极性溶剂对对节白蜡树叶中挥发性物质的提取效率有明显的差异，其中乙醚最佳，对挥发性物质的提取率可达2.68%，石油醚和二氯甲烷的提取效果相对较差，说明挥发性物质中含有较多极性较高的物质。

表1 不同极性溶剂对对节白蜡树叶中挥发性物质的提取效率

2.2 温度、时间对乙醚提取对节白蜡树叶中挥发性物质的影响

选取提取效率较高的乙醚作为萃取溶剂，考察了提取时间、温度对提取效率的影响，结果如表2所示。从表2可见，乙醚对对节白蜡树叶中挥发性物质的提取效率随提取时间的延长而提高，但是提高幅度随时间延长而减小，考虑到天然物质的热稳定性等因素，认为6 h最佳。乙醚对对节白蜡树叶中挥发性物质的提取效率受提取温度的影响非常大，当把提取温度降为80 ℃时，6 h的提取率仅为0.58%，较100 ℃降低了78.36%，因此，提取温度以100 ℃为最佳。

表2 温度、时间对乙醚提取对节白蜡树叶中挥发性物质的影响

2.3 乙醚提取物的GC-MS 分析及所含化合物的结构和名称

对乙醚提取物进行了GC-MS 分析，得到总离子流图，如图1所示，结果显示，除去溶剂峰，乙醚作溶剂进行同时蒸馏萃取得到的挥发性物质主要含有5个可分辨的峰，其中保留时间为3.451 min处的1号峰和22.517 min处的4号峰为2个最主要的峰，面积归一含量分别为9.41%和87.00%，两者之和高达96.41%(表3)。引人注意的是，乙醚提取物有特别宜人的蜂蜜香味，具有开发植物精油的潜在价值。

图1 乙醚提取物GC-MS总离子流图

化合物编号保留时间/min归一含量/%检索结构及名称最高相似度/%13.4519.41(丙酰胺)6127.9530.88(丁二腈)90320.5881.44(蒽)99422.51787.00(邻苯二甲酸二丁酯)98531.0631.28(正二十三烷)83

针对总离子流图中的主要组分进行NIST11 谱库检索，并根据离子峰辅以人工解析、结构筛选，得到乙醚提取物中所含化合物的结构，如表3所示。结果显示，4号组分占总提取物含量的87.00%，为最主要的组分，经NIST11谱库检索其为邻苯二甲酸二丁酯，相似度为98%。

2.4 乙醚提取物对供试病原菌的生物活性

由表4可知，乙醚提取物对5种供试病原菌都有一定的杀菌活性，其中对水稻纹枯病菌的效果最好，在500 μg/mL的质量浓度下抑制率可达100%，在250 μg/mL的质量浓度下抑制率仍可达到65.0%；其在500 μg/mL的质量浓度下对小麦赤霉病菌的抑制率也能达到55.8%；而对其他3种病原菌的杀菌活性相对较差，在500 μg/mL的质量浓度下对马铃薯早疫病菌、核桃根腐病菌和油菜菌核病菌的抑制率分别为40.5%、11.5%和32.3%。GC-MS分析表明，含量占乙醚提取物87.00%的组分为邻苯二甲酸二丁酯，因此可初步确定邻苯二甲酸二丁酯为对节白蜡重要的抗菌成分之一。

表4 乙醚提取物的杀菌活性

3 结论与讨论

本研究采用同时蒸馏萃取法对对节白蜡树叶中的挥发性物质进行分离提取，并对萃取溶剂、温度和时间进行了筛选，结果显示，萃取溶剂以乙醚为最佳，萃取最佳温度为100 ℃，最佳时间为6 h。对乙醚提取物进行杀菌活性测试发现，乙醚提取物对5种供试病原菌都有一定的杀菌活性，其中对水稻纹枯病菌的效果最好，在500 μg/mL的质量浓度下抑制率可达100%，在250 μg/mL的质量浓度下抑制率仍可达到65.0%，其在500 μg/mL的质量浓度下对小麦赤霉病菌的抑制率也能达到55.8%。为进一步探寻乙醚提取物具有杀菌活性的原因，又对乙醚提取物进行了GC-MS分析，确定了乙醚提取物中的物质组成及各物质的结构。结果显示，乙醚提取的挥发性物质主要含有5个可分辨的成分，其中4号组分占总提取物含量的87.00%，为最主要的组分，经NIST11谱库检索其为邻苯二甲酸二丁酯，相似度为98%。

邻苯二甲酸二丁酯具有广泛的用途：可作为优良的增塑剂改善塑料制品的柔软性，也可作为溶剂或者杀虫剂使用，同时还具有芳香味，可作为香料的定香剂[14]。近年来，许多研究表明，邻苯二甲酸二丁酯作为一种植物源物质，存在于很多植物中，如从玉米[15]、大豆[16]、辣椒[17]、茄子[18]等植物的根系分泌物及番茄[19]等植株成分中均分离鉴定出该物质。研究发现，邻苯二甲酸二丁酯具有多种生物活性。李轶修等[20]研究表明，邻苯二甲酸二丁酯对茄子种子萌发及幼苗的生长具有低浓度促进、高浓度抑制的作用；周宝利等[18]报道，邻苯二甲酸二丁酯对茄子根际黄萎菌具有抑制作用。而本研究结果表明，含有87.00%邻苯二甲酸二丁酯的对节白蜡树叶乙醚提取物，对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌等5种病原菌都有一定的杀菌活性，其中，在500 μg/mL的质量浓度下对水稻纹枯病菌的抑制率可达100%，在250 μg/mL的质量浓度下抑制率仍可达到65.0%。因此，可初步确定邻苯二甲酸二丁酯是对节白蜡重要的抗菌成分之一，该结果对研究对节白蜡具抗病性的原因以及在此基础上开发植物源绿色杀菌剂都具有十分重要的意义。

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Extraction,GC-MS Analysis and Fungicidal Activity Determination of Volatile Components from the Leaves ofFraxinushupehensis

ZHANG Liangju,XU Huihui,XU Zhihong,LI Junkai,WU Qinglai*

(School of Agriculture,Yangtze University,Jingzhou 434025,China)

In order to study the reason for disease resistance ofFraxinushupehensisand develop new biological pesticides,the volatile components ofFraxinushupehensisleaves were extracted by simultaneous distillation extraction(SDE) method．The suitable factors such as solvent,temperature and time in SDE method were chosen.The results showed that the optimum extraction solvent was ether,the optimum extraction temperature was 100 ℃ and the optimum extraction time was 6 h.The fungicidal activities of the ethereal extract were testedinvitro.The bioassay results indicated that the ethereal extract showed some fungicidal activities against all tested fungi at the concentration of 500 g/mL.In particular,the ethereal extract showed the best fungicidal activity againstRhizoctoniasolaniwith the inhibition rate of 100%,and also showed good fungicidal activity againstFusariumgraminearumwith the inhibition rate of 55.8%.The ethereal extract was analyzed by GC-MS method.The results showed that the ethereal extract had five compounds,and the component 4 accounted for 87.00% of the total ethereal extract.The structure of the component 4 was identified as 1,2-benzenedicarboxylic acid dibutyl ester by retrieving the NIST11 gallery.These results preliminarily confirmed that 1,2-benzenedicarboxylic acid dibutyl ester was one of the important antifungal components inFraxinushupehensis.

Fraxinushupehensis; simultaneous distillation extraction(SDE) method; extract; GC-MS analysis; fungicide activity; biological pesticide

2016-11-22

国家自然科学基金项目(30971948)；湖北省自然科学基金项目(2014CF105)

张良菊(1996-)，女，湖北荆州人，在读硕士研究生，研究方向：绿色新农药创制。E-mail:2683358095@qq.com

*通讯作者：吴清来(1977-)，男，湖南株洲人，讲师，博士，主要从事仪器分析教学和绿色新农药创制研究工作。 E-mail:wql106@163.com

S476

A

1004-3268(2017)06-0080-04