活血凉血法对氧糖剥夺大鼠星形胶质细胞内神经营养因子的影响*

石冬燕 朱 元 常 诚

（南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

·研究报告·

活血凉血法对氧糖剥夺大鼠星形胶质细胞内神经营养因子的影响*

石冬燕 朱 元 常 诚△

（南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

目的 观察活血凉血法作用于脑缺血缺氧大鼠脑微血管内皮细胞（BMEC）后的条件培养基对星形胶质细胞（AS）内神经营养因子（NT）的影响。方法 采用氧糖剥夺法获得正常、激活、激活合通络救脑注射液处理、损伤、损伤合通络救脑注射液处理5个不同状态的BMEC条件培养基。同法建立AS损伤模型并分成7组，加入相应BMEC条件培养基：正常对照组（N）、模型组（I）、条件培养基处理的正常组（NCM）、条件培养基处理的激活组（ACM）、条件培养基处理的激活给药组（ACM-T）、条件培养基处理的损伤组（ICM）、条件培养基处理的损伤给药组（ICM-T）。观察AS活性，并检测BDNF、GDNF的表达量。结果 正常、激活和损伤状态的BMEC条件培养基均可提高受损AS活性，并显著升高其分泌BDNF、GDNF的量，其促进程度分别为激活组＞正常组＞损伤组。凉血活血之通络救脑注射液作用于激活BMEC后，其条件培养基具有促进AS分泌BDNF、GDNF的功能。结论 活血凉血的通络救脑注射液可通过提高受损星型胶质细胞活性并促进其分泌NT来减轻脑缺血缺氧时神经细胞的损伤，促进神经细胞功能的恢复，其可能是治疗脑缺血缺氧的潜在药物。

活血凉血法 脑微血管内皮细胞 星形胶质细胞 神经生长因子 通络救脑注射液

神经营养因子（NT）是一种主要由星形胶质细胞（AS）产生的蛋白质或多肽分子，它有助于神经元的生长和存活，可以促进神经元细胞体合成相关的蛋白质，进而发挥支持神经元生长、发育和功能完整性的作用。研究表明，脑组织缺血缺氧时，AS可分泌神经营养因子［主要为脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质源性神经营养因子（GDNF）］以减少神经元的损伤，其机制主要是BDNF、GDNF可减少钙超载、抗自由基、抑制谷氨酸毒性、减少细胞毒等从而保护受损的神经元，促进神经功能的恢复［1-2］。

神经血管单元 （NVU）指脑微血管内皮细胞（BMEC）、周围的星型胶质细胞突起和由这些突起所支持的神经元及其轴突一起构成的复合体。脑缺血缺氧可引起中医学中风、痴呆、眩晕等多种疾病（类似于西医的脑梗死、血管性痴呆、后循环缺血等），这些疾病迁延不愈均可导致体内瘀血积聚，日久化火，使得疾病的治疗更为棘手。那么能否利用NVU之间的关系减轻脑缺血缺氧所致的后果及利用药物加强NVU之间的相互作用，促进脑保护，延缓脑缺血缺氧所致疾病的病程，是研究的一个方向。

通络救脑注射液是天津红日药业有限公司新研发的产品，其主要成分为三七总皂苷及栀子苷，旨在通过活血凉血法作用于缺血缺氧的脑组织，以寻求治疗脑缺血缺氧的一种新途径。在此前提下，本研究利用氧糖剥夺法构建脑缺血缺氧的体外模型，将活血凉血之通络救脑注射液作用于BMEC后制成不同状态的培养基，用此培养受损的AS，观察AS活性及GDNF、BDNF表达变化，以期探索BMEC在病理状态时对AS脑的保护作用及通络救脑注射液可能的作用途径，从而寻找治疗中风、痴呆、眩晕等疾病的有效方药，减轻社会、患者家庭经济及精神负担。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠，体质量60～70 g，雄性；出生48 h内的Wistar大鼠，雄性，两者均购自维通利华动物中心。

1.2 药物与试剂 DMEM培养基干粉：Gibco公司（美国）。胎牛血清：金马生物技术公司。胰蛋白、EDTA、明胶、原酶Ⅱ型：Sigma公司（美国）。通络救脑注射液：红日药业有限公司。兔抗大鼠GFAP及鼠ICAM-1单克隆抗体：abcam公司（美国）。山羊抗兔二抗（辣根过氧化物酶标记）：北京康为世纪生物技术公司。分离胶缓冲液、聚丙烯酰胺溶液、浓缩胶缓冲液、酸性定影粉、上样缓冲液：普利莱技术公司。RIPA裂解液：碧云天生物公司。

1.3 BMEC分离及培养 利用本实验室已建立的方法［3］。取SD大鼠，收集大脑皮质，剪碎、匀浆、过滤，取74 μm滤网上的微血管段，采用0.2%Ⅱ型胶原酶37℃水浴中消化20 min左右，离心（1000 r/min，5 min）所得到的沉淀用冲洗液清洗2次，用内皮细胞培养基悬浮后，接种在有明胶覆盖的25 cm2培养瓶中，放在37℃、5%CO2孵箱中进行原代培养，48～72 h后首次更换培养基1次，后每3日进行1次更换培养基。细胞生长至80%～90%时用含0.04%EDTA的0.1%胰蛋白酶消化后继续培养。本研究使用第3代细胞。

1.4 AS分离、纯化、培养及鉴定 取Wistar大鼠，收集大脑皮质。剪碎，用0.125%胰蛋白酶37℃消化25 min收集在离心管中，2000 r/min离心5 min，去上清，细口径吸管吹打至均匀的细胞悬液后用200目不滤网过滤成为单细胞悬液。计数细胞，调整细胞密度至5× 108/L，接种在75 cm2培养瓶中，静置30 min后吸出重新接种在预先用0.001%多聚赖氨酸包被的培养瓶里，放在饱和湿度、37℃、5%CO2的培养箱里培养。1 d后更换全部培养基，以后每2日更换一半培养基。第8日细胞生长成为单层片状时，更换全部培养基，继续在培养箱里孵育2 h，然后放在37℃恒温摇床上，240 r/min振荡18 h。去掉所有培养基，采用预温解剖液清洗3次，从而去掉小胶质细胞及寡突胶质细胞。继续消化传代，37℃、5%CO2孵育，GFAP染色鉴定后分组及实验，本研究使用第3代细胞。

1.5 建立脑微血管内皮细胞激活及损伤模型 采用氧糖剥夺法［4］，将第3代BMEC分为8组，以D-Hank’s液清洗2次后换成无糖Kreb’s液，分别置37℃、95% N2、5%CO2的缺氧培养箱里培养0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h。1）MTT法检测每组BMEC的活性，根据结果得出造成BMEC激活及损伤的时间分别为0.5 h、2 h。2）Western Blot法分析正常、激活、损伤3个时间点BMEC细胞间黏附分子 （ICAM-1）的不同表达，验证BMEC激活及损伤模型。

1.6 制备及收集不同状态BMEC条件培养基 将第3代BMEC分为5组：1）正常组：正常培养的BMEC，未进行任何处理；2）激活组：根据前述氧糖剥夺法制成BMEC激活模型；3）激活给药组：制成激活模型，同时在造模前4 h及造模过程中，以2 μL/mL质量浓度加进通络救脑注射液（已有实验证明2 μL/mL是最适合质量浓度［5］）；4）损伤组：同法制成BMEC损伤模型；5）损伤给药组：制成损伤模型，同时在造模前4 h及造模过程中，以2 μL/mL浓度加进通络救脑注射液。每组处理结束后，换成无血清的DMEM培养基，37℃、5% CO2培养箱里培养6 h，收集各组培养上清，分别作为正常BMEC条件培养基（NCM）、BMEC激活条件培养基 （ACM）、BMEC激活合通络救脑注射液给药条件培养基（ACM-T）、BMEC损伤条件培养基（ICM）、MEC损伤合通络救脑注射液给药B条件培养基（ICM-T）。

1.7 建立大鼠AS模型并用相应条件培养基处理 用前述方法建立AS损伤模型，确定AS激活、损伤造模时间分别为2 h、8 h。将损伤的AS分为7组，并用相应条件培养基处理，即正常对照组（N）、模型组（I）、条件培养基处理的正常组（NCM）、条件培养基处理的激活组（ACM）、条件培养基处理的激活给药组（ACM-T）、条件培养基处理的损伤组（ICM）、条件培养基处理的损伤给药组（ICM-T），静置培养过夜（约12 h）。

1.8 指标检测Westen blot法检测 各组AS BDNF、GDNF表达量。裂解AS细胞，提取总蛋白，ABC法定量蛋白后，各样品取50 μg总蛋白，制备10%的分离胶，充分分离目的蛋白后转移到PVDF膜。将膜放在含有5%脱脂奶粉的自封袋里，室温摇床1 h，TBST洗膜，5 min×3次。将膜置于含一抗自封袋中4℃孵育过夜（BDNF：1∶5000。GDNF：1∶100），TBST洗膜，5 min×3次。将膜放在含有1∶3000辣根过氧化酶标记的的山羊抗兔的二抗 （用5%BSA配成）自封袋里室温下培养2～3 h，TBST洗膜，5 min×3次。将ECL plus的A、B发光液1∶1混合均匀后加在膜上，吸干膜上多余的发光液，用曝光机（Tanon 4500）曝光及扫描条带。用Band Scan软件分析目的蛋白及内参蛋白的灰度值，得到目的蛋白的相对表达量。

1.9 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，通过单因素方差分析组之间的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同BMEC条件培养基对受损AS活性的影响见表1。与正常组比较，8 h后模型组AS活性显著降低（P＜0.001），提示AS拟缺血损伤模型制作成功。与I组比较，NCM组、ACM组及ICM组OD值显著升高（P＜0.001），提示正常、激活及损伤的BMEC条件培养基均可以显著提高受损AS的活性。与ACM组相比，ACM-T组OD值升高更加显著（P＜0.05），与ICM组相比，ICM-T组OD值也明显升高（P＜0.05），提示活血凉血之通络救脑注射液作用于激活及损伤BMEC后，其条件培养基可明显增强AS活性。

表1 不同状态的BMEC条件培养基对受损AS活性的影响（±s）

表1 不同状态的BMEC条件培养基对受损AS活性的影响（±s）

与N组比较，***P＜0.001；与I组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与ACM组比较，△P＜0.05；与ICM组比较，★P＜0.05。下同。

组别 n OD值N组 61.72±0.11 I组 6 NCM组 6 0.39±0.06***1.71±0.03###ACM组 6 ACM-T组 6 1.72±0.08△ICM组 6 1.39±0.22###ICM-T组 6 1.60±0.10★1.49±0.03###

2.2 不同状态的BMEC条件培养基对损伤AS分泌BDNF的影响 如表2及图1，与正常组相比，模型组BDNF显著降低（P＜0.001），提示脑缺血缺氧造模成功后损伤的AS分泌BDNF明显降低。与模型组相比，NCM组及ACM组分泌BDNF明显升高（P＜0.05或P＜0.01），提示正常、激活状态的BMEC条件培养基都可显著促进AS分泌BDNF；与ACM组相比，ACM-T组BDNF表达量明显升高 （P＜0.01），与ICM组相比，ICM-T组BDNF表达量差异无统计学意义，提示通络救脑注射液作用于激活BMEC后，其条件培养基可促进AS分泌BDNF，增强AS保护神经元的功能。

表2 不同BMEC条件培养基对受损AS表达BDNF的影响（±s）

表2 不同BMEC条件培养基对受损AS表达BDNF的影响（±s）

组别 n OD值N组 61.00±0.00 I组 6 NCM组 6 0.43±0.03***0.96±0.05##ACM组 6 ACM-T组 6 1.37±0.08△△ICM组 6 0.43±0.12 ICM-T组 6 0.58±0.20 0.78±0.06#

图1 不同BMEC条件培养基对受损AS表达BDNF的影响

2.3 不同状态的BMEC条件培养基对受损AS分泌GDNF的影响 如表3，图2，与正常组相比，模型组GDNF显著降低（P＜0.001），提示脑缺血缺氧造模成功后损伤的AS分泌GDNF明显降低。与模型组相比，NCM组及ACM组分泌GDNF明显升高 （P＜0.05或P＜0.01），提示正常、激活状态的BMEC条件培养基都可显著促进AS分泌GDNF；与ACM组相比，ACMT组GDNF表达量明显升高（P＜0.01），与ICM组相比，ICM-T组GDNF表达量差异无统计学意义，证明活血凉血之通络救脑注射液作用于激活BMEC后，其条件培养基可促进AS分泌GDNF，增强AS保护神经元的功能。

表3 不同BMEC条件培养基对受损AS表达GDNF的影响（±s）

表3 不同BMEC条件培养基对受损AS表达GDNF的影响（±s）

组别 n OD值N组 61.00±0.00 I组 6 NCM组 6 0.51±0.06***0.87±0.07##ACM组 6 ACM-T组 6 1.08±0.05△△ICM组 6 0.67±0.14 ICM-T组 6 0.68±0.10 0.82±0.12#

图2 不同BMEC条件培养基对受损AS分泌GDNF的影响

3 讨 论

AS是哺乳动物脑中分布最广的细胞。AS体积也是神经胶质细胞中最大的。它可通过一系列作用支持神经元的正常功能，包括提供营养、改善微环境、支持神经干细胞、参与糖代谢及修复血脑屏障等。大量的AS在脑缺血缺氧期间被激活并通过多种方式对神经元产生保护作用，包括合成与分泌NT、缓冲细胞外钾离子及谷氨酸盐、代谢多种神经递质等，进而使神经细胞外内环境保持稳定，降低神经元的损伤，最终维持了神经元的正常生理功能［6］。本研究中笔者观察到正常组及造模2 h后AS被激活，可分泌大量的BDNF和GDNF，显示了AS功能存在时可保护神经元。

BDNF和GDNF是AS在脑缺血缺氧损伤期间分泌的两种主要神经营养因子［7］。BDNF和GDNF可营养神经元，促进轴突再生，增强神经元抵抗损伤的耐受性，抑制神经元变性和死亡［8］。研究发现脑缺血缺氧后BDNF及其受体表达水平显著提高，并对应于固定的时间及分布区域，BDNF可稳定钙浓度、降低自由基损伤、抑制神经元凋亡同时促进其再生，从而恢复损伤的神经元功能［7］。AS还通过分泌GDNF保护缺血缺氧的神经元。大鼠脑缺血缺氧后给予外源GDNF可促进神经元修复损伤，降低迟发性神经元死亡［9-10］。这与本研究的结果一致，且活血凉血之通络救脑注射液可显著促进激活组、损伤组产生NT。

随着神经科学研究的深入，越来越多人开始重视神经血管单元。提出这个概念是为了强调神经元、神经胶质细胞和脑微血管细胞（BMEC）之间重要的相互联系和影响，同时要求在一个小型的三维环境里，从整体上研究神经元损伤和保护机制，那么在这个理论指导下，脑缺血缺氧时，神经血管单元三个因素之间又是如何相互作用来保护神经元的呢？药物干预下，BMEC对AS分泌NT的功能会产生什么影响？本研究对体外培养细胞模型进行了深层次研究。笔者先制成不同状态BMEC条件培养基，再利用相同的方法制备损伤AS模型，分组后加入对应的BMEC条件培养基，观察AS活性，同时检测其分泌BDNF、GDNF的量。结果显示与正常组相比，模型组AS分泌BDNF、GDNF明显减少，证明造模成功后损伤的AS分泌BDNF、GDNF明显降低。与模型组相比，NCM组及ACM组产生BDNF、GDNF的量明显增多，显示正常、激活状态的BMEC条件培养基都可显著促进AS分泌BDNF、GDNF，显示了其可促进AS分泌NT。

中医学认为，脑组织缺血缺氧的基本病理变化不外乎虚实两端，虚者为髓海不足或气血不足，清窍失养，实者则为风、火、痰、瘀蒙蔽脑窍。无论其证属虚属实，日久均可因气血运行不畅而导致瘀血内生或原有瘀血症状加重。同时，现代生活水平的提高使得已有脑组织缺血缺氧患者的饮食控制更加困难，肥甘厚味、辛香炙煿甚至饮酒等使得瘀血化火，如此恶性循环，酿生血瘀、血热的病理机制，使得缺血缺氧后的脑组织受损进一步加重，致使其所产生的中风、痴呆、眩晕等疾病的病理机制更加复杂、病情加深、病程迁延、治疗及预后欠佳。通络救脑注射液的主要有效成分为三七总皂苷及栀子苷。三七可活血化瘀止痛，栀子可凉血止血、清热解毒，两药相合可起到很好的活血凉血之功效。研究表明，脑缺血缺氧后活血法可利用增加脑组织内NT含量、改善认知、加强神经功能的恢复等途径来减慢血管性痴呆大鼠的疾病过程，活血法可联合补肾、益气、疏肝等各种方法来加强神经组织分泌NT的作用［11-12］。凉血法不但可以保护脑缺血缺氧后的BMEC，还可增加NT含量［13-14］。药理研究发现三七皂苷能够祛除自由基、抑制脂质过氧化、减轻Ca2+内流、减少血小板聚集、扩张血管、改善微循环、减轻炎症［15］；栀子苷能减轻炎性反应并保护BMEC，进而对抗脑缺血损伤后发生的一系列反应［16］。有研究显示通络救脑注射液可使BMEC分泌IGF1增多，降低血清NSE浓度以保护BMEC进而保护神经元［17］。研究还发现，通络救脑注射液能够抑制脑缺血大鼠脑组织表达Sema3A，提高GAP43含量同时缩小脑梗死体积，从而保护缺血缺氧的脑组织［18］。本研究中通络救脑注射液作用于激活及损伤BMEC后，其条件培养基增强AS活性的作用显著提高，同时AS所分泌的BDNF、GDNF量明显增多，提示通络救脑注射液作用于不同状态的BMEC培养基后，能够增强AS活性，并促进其分泌NT。

总之，本研究初步探讨了BMEC作用于受损AS后对其活性和分泌NT的影响，及活血凉血之通络救脑注射液对其保护功能的促进作用。但研究未能明确BMEC作用于AS脑保护的作用机制，能否进一步寻找到相关的靶点及通络救脑注射液可能的靶向作用将是今后进一步研究的方向。

［1］ Sjmny，Bamive.Calium transients in astrocyte endfeetcause cerebrovascular constrictions［J］.Nature，2004，431（7005）：195-199.

［2］ 付美红，李海涛．脑源性神经营养因子与脑缺血的研究进展［J］．安徽医药，2012，16（6）：717-720．

［3］ 李卫红，青雪梅，华茜．大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液对皮层神经元活性的影响以及通络救脑注射液的干预作用［J］．中华中医药杂志，2006，6（21）：334-337．

［4］ Chen Tao，Liu Wei，Chao Xiao.Neuroprotective effect of osthole against oxygen and glucose deprivation in rat cortical neuronsinvolvement of mitogen-activated protein kinase pathway［J］.Neurosci，2011，1（183）：203-211.

［5］ 朱元．从内皮-胶质细胞信息网络解析脑络功能及通络救脑注射液干预特征［D］．北京：北京中医药大学，2012．

［6］ 胡星，王军，韦峰，等．小分子量透明质酸促进星形胶质细胞中脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子的表达［J］．中国组织工程研究，2012，16（28）：5216-5221．

［7］ 杨直堂．活化小胶质细胞在急性脑梗死中的作用及其机制的研究［D］．郑州：郑州大学，2013．

［8］ 杨晓帆，韩鹏飞，臧兆萍，等．骨髓间充质干细胞移植对局灶性脑缺血大鼠星形胶质细胞的影响［J］．中国医院用药评价与分析，2015，15（12）：1619-1621．

［9］ Zbrrten，Basine.Differential effects of paracrine factors on the survival of cells of the neurovascular unit during oxygen glucose deprivation［J］.Int J Stroke，2015，10（3）：407-414.

［10］Gwinegime，Xiney.Dynamic expression of glial cell line-derived neurotrophic factor after cerebral ischmia［J］.Neuroreport，2000，6（11）：1177-1183.

［11］于文涛，张一昕，张杰．补肾活血方对血管性痴呆小鼠脑组织BDNF和bFGF含量的影响［J］．中国老年学杂志，2011，31（24）：4834-4836．

［12］龙志江，谢辉，孟琼．不同活血中药配伍对脑缺血大鼠海马BDNF表达的实验研究［J］．中医药导报，2016，22（2）：20-23．

［13］黄艳，赵凤鸣，梁晓雯，等．凉血通瘀方对血管内皮细胞分泌NO及NOS的影响［J］．中药药理与临床，2010，26（3）：55-57．

［14］武衡，黎杏群，唐涛，等.脑溢安对脑出血大鼠脑源性神经营养因子蛋白表达的影响［J］．湖南医科大学学报，2003，28（5）：485-489.

［15］王根发，王文安，周永炜．三七皂苷对脑缺血对大鼠再灌注损伤的保护作用［J］．中国临床康复，2002，9（6）：1268-1269．

［16］徐丽伟．TWEAK-Fn14-NF-κB通路在脑缺血病理过程中的变化及通络方药的干预机制［D］．北京：北京中医药大学，2012．

［17］张玮，唐卉凌，Peiman，等．IGF1在脑缺血大鼠脑组织中的表达与通络救脑注射液的脑保护作用［J］．现代生物医学进展，2010，10（5）：840-842．

［18］唐卉凌，李澎涛，张玮，等．Semaphorin 3A在局灶性脑缺血大鼠脑组织中的表达特征及通络救脑注射液的保护作用［J］．世界科学技术：中医药现代化，2010，12（3）：363-367．

Effect of Blood-Activating and Cooling-blood Method on Neurotrophin in Astrocytes of Oxygen-glucoseDeprived Rats

SHI Dongyan，ZHU Yuan，CHANG Cheng. The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210029，China.

Objective：To study the effect of blood-activating and cooling-blood method on neurotrophin in astrocytes of oxygen-glucose deprived rats by conditioned medium of rat brain microvascular endothelial cells（BMEC）.Methods：Five different states of BMEC conditions medium with oxygen-glucose-deprivation legal system called normal，active，activate merge Tongluo Jiunao Injection process，damage，and injury combined Tongluo Jiunao Injection process were made.The injured AS models were made in the same way and divided it into seven groups，being added the corresponding BMEC conditioned medium，namely normal controlled group（N），model group（I），the normal group treated with conditioned medium（NCM），activated group treated with conditioned medium （ACM），activated conditioned medium administration group treated group（ACM-T），injured group treated with conditioned medium （ICM），damage administration group treated with conditioned medium（ICM-T）.The activity of AS was observed and the amount of BDNF&GDNF came from AS was detected.Results：All of the normal，active and damage BMEC conditions states could significantly increase the activity of impaired AS and then significantly increase its secretion of BDNF&GDNF，the sequence of promotive effect was the activated group＞the normal group＞the injured group.When Tongluo Jiunao Injection was acted on the activated BMEC as a conditioned medium，it could promote the secretion of neurotrophin from AS.Conclusion：Tongluo Jiunao Injection has the blood-activating and cooling-blood function.It can significantly improve the activity of AS and promote the secretion of neurotrophin to reduce damage to the nerve cells when cerebral hypoxiaischemia happens，promote the recovery of nerve cell function which shows that it is a potential drug to treat cerebral hypoxia-ischemia.

Blood-activating and cooling-blood method；Brain microvascular endothelial cells；Astrocytes；Neurotrophin；Tongluo Jiunao Injection

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0756-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.002

2017-02-08）

国家自然科学基金资助项目（81673759）；江苏省六大高峰人才资助项目（2013WS-034）

△通信作者（电子邮箱：chch1967@163.com）