黑萨福克和杜泊羊新鲜和冷冻胚胎移植效率的研究

徐志远，杨明辉，姬鹏云，张效生，张金龙，朱士恩，阿布力孜·吾斯曼，赵 静，刘国世*

（1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；3.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；4.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

黑萨福克和杜泊羊新鲜和冷冻胚胎移植效率的研究

徐志远1,2，杨明辉2，姬鹏云2，张效生3，张金龙3，朱士恩2，阿布力孜·吾斯曼4，赵 静1*，刘国世2*

（1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；3.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；4.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

为提高优质肉用种用绵羊胚胎移植的效率，试验选取76只黑萨福克羊和27只杜泊羊作为供体，采用“CIDR+FSH+PMSG ”法进行超数排卵处理。选取384只小尾寒羊为受体，采用“CIDR+PMSG”法进行同期发情处理，以探索供体胚胎发育阶段、胚胎冷冻处理、胚胎体外停留时间以及移植给受体时移植侧黄体数量等因素对胚胎移植妊娠率的影响。 结果表明：移植新鲜囊胚的妊娠率极显著高于桑椹胚（P＜0.01）；冷冻/解冻囊胚移植妊娠率极显著低于新鲜囊胚（P＜0.01），而冷冻/解冻桑椹胚移植妊娠率与新鲜桑椹胚无显著差异（P＞0.05）；此外，移植桑椹胚时，移植侧有1个黄体的受体妊娠率极显著低于有2～3个黄体受体妊娠率（P＜0.01），但移植囊胚时两者间差异不显著（P＞0.05）。综上可知，子宫角移植桑椹胚和囊胚时，移植新鲜囊胚、移植冷冻桑椹胚效率较高；将新鲜桑椹胚移植给移植侧有2～3个黄体受体效果好于1个黄体受体。

绵羊；桑椹胚；囊胚；冷冻胚胎；受体黄体数；妊娠率

近年来黑萨福克羊和杜泊羊作为肉用种羊在我国一直广受欢迎，养殖经济效益很大，但由于自然繁殖效率低，加之引种到国内的时间不长，扩繁种群有限，在我国仍然处于小群体状态。超数排卵、人工授精、胚胎移植等技术配合应用能够极显著提高良种的扩繁效率。易金云等[1]报道，利用CIDR+FSH+PMSG递减4 d 8针注射法对黑萨福克羊进行超数排卵获得可用胚数高达16.8枚，对杜泊羊进行超排获得可用胚数达到了14.3枚。李爱朵等[2]报道，利用内窥镜子宫角输精法输精，萨福克羊供体受精率高达97.02%。王赛赛等[3]报道，采用子宫角冲胚法获得的杜泊羊可用胚胎丢失少，而且术后发生粘连的可能性较小。包花拉等[4]报道，杜泊羊供体同期发情主要集中在撤栓后的12～36 h，受体小尾寒羊主要集中在撤栓后的24～48 h。然而关于这两种肉用绵羊胚胎移植过程中的影响因素及如何获得更高的移植妊娠率报道较少。

本试验在生产条件下，分析了黑萨福克羊、杜泊羊作为供体时胚胎的发育阶段、胚胎冷冻处理、胚胎体外停留时间以及移植给受体时移植侧黄体情况等因素对受体移植后妊娠率的影响，筛选出较好的移植方案，以期为生产实际应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 试验于2015年1月和5月在河北省遵化市某羊场进行。供体绵羊为76只黑萨福克羊和27只杜泊羊，年龄2～6岁，无生殖系统疾病，超排处理前已有2个以上正常的发情周期。受体羊为654只小尾寒羊，年龄1.5～4岁，无生殖系统疾病，膘情适中，试验前适当补饲。

1.2 试验器械及试剂药品 试验器械包括假阴道，集精杯，移动式保定架，输精枪，腹腔镜，导尿管，水浴锅，实体显微镜，移植针，手术器械、B超仪等。试剂药品中，促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、孕马血清促性腺激素（PMSG）来自宁波三生药业有限公司；促排3号（LRH-A3）购自丹东市绿丹和华动物制药有限公司；阴道栓（CIDR）为新西兰产，20个/袋，孕酮含量为1.38 g/个；Holding培养液为新西兰产，50 mL/袋；PBS（冲卵液）为新西兰产；长效土霉素注射液产自美国辉瑞，100 mL/瓶；75%酒精、碘酒、新洁尔灭、抗生素、生理盐水等均为国产。

1.3 试验设计 本试验分胚胎发育不同阶段、胚胎是否经历冷冻保存、早发情供体与晚发情供体、胚胎移植前在体外环境下停留的不同时间与受体羊移植侧卵巢不同黄体数共5组因素对胚胎移植后妊娠效果进行比较试验。每组因素的试验都是在其他因素基本一致的条件下进行。

1.4 供体超数排卵、人工授精、冲胚及胚胎分级供体超排参照易金云等[1]采用的CIDR+FSH（递减4 d 7针）+PMSG（ 1针）注射法。按照方案安排，供体在发情周期的任意一天1次放入CIDR，当天记为第0天，在此后的第10天，根据供体羊体重，开始注射相应剂量的FSH，每隔12 h注射1次，剂量递减，在注射FSH第7针后不久（第13天）取出CIDR，第7针之后12 h注射PMSG。供体羊在撤栓后12～48 h内试情，每隔6 h试情1次。于撤栓后48 h腹腔镜法子宫角输精，注射LH 100 IU。输精后5～6 d手术法冲出供体子宫中的桑椹胚和囊胚。将冲出的胚胎通过体视显微镜观察分为1、2、3、4级，分级标准：

1级胚胎：胚胎的形态正常，发育速度与胚胎日龄一致，卵裂球排列紧密适度，大小、色泽均匀，透明带完整。

2级胚胎：发育速度与胚胎日龄基本一致，卵裂球排列不太紧密，轮廓清晰，个别卵裂球大，透明带完整。

3级胚胎：卵裂球排列松散，轮廓不清晰，色泽过暗，有的破裂呈沙粒样，有碎片；透明带不完整。

4级胚胎：变性胚、退化胚。

1、2级胚胎可以进行移植，但本试验只对1级胚胎移植结果进行分析。

1.5 受体的同期发情处理 在受体绵羊发情周期的任意一天放置CIDR，第13天注射PMSG并取出CIDR，于撤栓后24～48 h期间利用公羊试情。严格控制供受体发情同步差，使两者在理论上不超过12 h。

1.6 胚胎移植方法 采用腹腔镜微创手术法将桑椹胚或囊胚移植到与供体同步发情的受体羊子宫角中。

1.7 冷冻/解冻胚胎 冷冻胚胎全为杜泊绵羊胚胎，于澳大利亚进口，为程序化慢速冷冻、细管保存。解冻方法为三步法解冻。

1.8 试验羊术后处理及受体妊娠诊断 供体受体羊术后肌肉注射长效土霉素5 mL，圈舍保持干燥清洁，供体给予充足水料并多观察，以保证术后恢复良好。受体于移植后60 d通过B超仪诊断妊娠与否，妊娠受体单独分群并适当补饲。

1.9 统计分析 试验数据经Excel 2003软件处理后，使用SPSS20.0软件对妊娠率数据进行卡方检验。

2 结 果

2.1 黑萨福克及杜泊羊胚胎发育阶段对受体妊娠的影响 由表1可知，本试验共用黑萨福克135枚鲜胚桑椹胚和86枚鲜胚囊胚、杜泊56枚桑椹胚和42枚囊胚，胚胎体外停留2.5 h内移植给撤栓5.5 d的受体羊，每只受体移植一枚1级桑椹胚（1M）或一枚1级囊胚（1B）。结果显示，受体移植囊胚的妊娠率极显著高于桑椹胚（P＜0.01）。移植相同阶段胚胎时，杜泊羊妊娠率略高于黑萨福克羊（P＞0.05）。

表1 囊胚移植与桑椹胚移植受体妊娠情况

2.2 冷冻及胚胎发育阶段对胚胎移植妊娠的影响如表2所示，冻胚桑椹胚（冻胚1M）、鲜胚桑椹胚（鲜胚1M）移植妊娠率分别为63.4%、 51.9%（P＞0.05）；然而冻胚囊胚（冻胚1B）、鲜胚囊胚（鲜胚1B）移植妊娠率分别为48.2%、 80.6%（P＜0.01）；此外，冻胚1M移植妊娠率也略高于冻胚1B移植妊娠率（P＞0.05）。

表2 冷冻、鲜胚移植后受体妊娠情况

2.3 供体发情早晚对冲胚时胚龄的影响 如表3所示，供体撤栓后12～48 h期间试情，12～24 h期间发情记为早发情供体（共22只），36～48 h期间发情记为晚发情供体（共18只），两组间在输精后5.5 d冲胚时囊胚所占比例差异极显著（P＜0.01），分别为81.7%、17.4%。

表3 供体发情早晚对冲胚时囊胚比例的影响

2.4 胚胎体外停留时间对受体妊娠的影响 由表4可知，黑萨福克和杜泊羊鲜胚随机移植过程中，桑椹胚在体外停留0.5～1、1～1.5、1.5～2.5 h，移植单个鲜胚桑椹胚（1M）的受体3组间妊娠率差异不显著（P＞0.05）；囊胚在体外停留0.5～1、1～1.5、1.5～2.5 h，移植单个鲜胚囊胚（1B）的受体3组间妊娠率差异也不显著（P＞0.05）。

表4 胚胎体外停留时间对受体妊娠的影响

2.5 受体羊移植侧和移植侧黄体数对受体妊娠影响

2.5.1 受体羊卵巢上黄体分布规律 本试验中384只受体小尾寒羊左右侧黄体总数为1～6枚。如表5所示，左侧0黄体、右侧1黄体占23.18%；左侧1黄体、右侧1黄体占21.16%；左侧1黄体、右侧0黄体占16.41%。

2.5.2 受体移植侧黄体数对妊娠的影响 如表6所示，黑萨福克和杜泊供体羊胚胎随机移植1枚桑椹胚（1M）时，受体羊移植侧有1个黄体妊娠率极显著低于移植侧有2～3枚黄体妊娠率（P＜0.01）；然而当移植1枚囊胚（1B）时，受体羊移植侧有1枚黄体与2～3枚黄体两者间妊娠率差异不显著（P＞0.05）。

表5 受体羊黄体分布情况 %

表6 受体移植侧黄体个数对妊娠的影响

3 讨 论

3.1 胚胎发育阶段对受体妊娠的影响 供受体生殖系统生理状态的同步性是胚胎移植成功与否的关键因素，供体羊与受体羊同期发情存在差异，撤栓后0～48 h内的发情时间不一致会最终导致卵巢上卵泡破裂排卵的时间不同[4]。在胚胎移植过程中，需要按照受体与供体发情时间相近的原则进行配对移植，即移植胚胎的阶段要与受体羊的生理状态尽可能吻合。张红等[5]研究表明，桑堪胚移植受胎率高于囊胚；而张金龙等[6]报道表明，囊胚移植的妊娠率显著高于桑葚胚。本试验结果表明，受体撤栓5.5 d杜泊和黑萨福克羊移植囊胚妊娠率分别高达88.1%和83.7%，远高于移植桑葚胚的妊娠率57.1%和50.4%，这与张金龙等[6]报道结果相一致。此外，供体品种黑萨福克和杜泊对移植妊娠无显著影响，不同于易金云等[1]报道的黑萨福克胚胎移植后的妊娠率显著低于杜泊羊，这可能是因为本试验中的2个品种间相同阶段的胚胎质量（全为1级胚胎）相差不大。

3.2 胚胎冷冻对移植妊娠的影响 张亮等[7]研究表明，冷冻桑椹胚和囊胚阶段的胚胎，移植后的受胎率囊胚显著高于桑椹胚。而王素梅等[8]的报道表明，冻胚桑椹胚与冻胚囊胚移植妊娠率差异不显著。本试验研究表明，受体撤栓5.5 d期间移植冷冻桑椹胚和冷冻囊胚的移植妊娠率差异不显著，这与王素梅等[8]的报道相一致。而本试验中，新鲜囊胚移植妊娠率极显著高于冷冻囊胚，而新鲜桑椹胚移植妊娠率与冷冻桑椹胚之间差异不显著，这可能与囊胚冷冻/解冻过程中易受到损伤有关[9]。

3.3 供体发情早晚对冲胚时胚龄的影响 本试验结果表明，供体输精后5.5 d冲胚时获得囊胚的比例与供体撤栓后发情早晚相关，撤栓后12～24 h期间发情的早发情供体冲胚时囊胚率高达81.7%，然而36～48 h期间发情的晚发情供体囊胚率只有17.4%。这可能是由不同供体个体间发情、排卵先后存在较大差距造成[3]。

3.4 胚胎体外停留时间对受体妊娠的影响 张金龙等[6]研究表明，波尔山羊胚胎在体外停留60 min内对移植成功率没有显著差异。张红等[5]报道，波尔山羊胚胎在体外停留时间4 h内对受体妊娠无显著影响。本试验结果表明，杜泊和黑萨福克供体绵羊胚胎移植过程中，无论桑葚胚还是囊胚，体外停留时间在2.5 h内不影响移植后的受体妊娠。

3.5 受体羊移植侧和黄体个数对妊娠率的影响 何振富等[10-11]研究表明，受体移植侧1个黄体与2个黄体对妊娠无显著影响。本试验的研究表明，移植囊胚时受体黄体数对妊娠没有影响，但移植桑椹胚时，受体移植侧2～3个黄体妊娠率更高，这可能与移植侧黄体数2～3个的受体较1个黄体的受体植入窗口期更长有关[12]。

4 结 论

在黑萨福克和杜泊羊胚胎移植过程中，5.5 d撤栓处理的受体子宫角移植桑椹胚和囊胚时，新鲜胚胎移植囊胚、冷冻胚胎移植桑椹胚效率较高；将新鲜桑椹胚移植给移植侧有2～3个黄体受体效果好于1个黄体受体。

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Study of Fresh and Frozen Embryo Transfer Ef ficiency of Black Suf f olk and Dorper Ewes

XU Zhi-yuan1,2, YANG Ming-hui2, JI Peng-yun2, ZHANG Xiao-sheng3, ZHANG Jin-long3, ZHU Shi-en2, Abulizi Wusiman4, ZHAO Jing1*, LIU Guo-shi2*

To improve the embryo transer eciency oelite species osheep with high meat quality, a total o76 Black Suolk and 27 Dorper ewes were treated by “CIDR+FSH+PMSG” methodor superovulation as donors. The 384 smalltailed han sheep were treated by “CIDR+PMSG” methodor estrus synchronization as receptors. It was explored to test the inuence odevelopmental stages oembryo,rozen processing othe embryo, embryo in vitro residence time and transplantation olateral corpus luteum number oreceptor on the pregnancy rates ater embryo transer. The pregnancy rate oblastocyst transplantation was signicantly higher than morula transplantation (P＜0.01) when a singleresh embryo was transplanted. Therozen/thaw blastocyst transplantation pregnancy rate was signicantly lower thanresh blastocyst (P＜0.01), but the dierence betweenrozen/thaw morula andresh morula was not signicant(P＞0.05). In addition, the pregnancy rate with transplanted morula would be signicantly aected (P＜0.01), the transplanted blastocyst would not be signicantly aected(P＞0.05), when the transplanted-side-ovary oreceptor had 1 corpus luteum or 2～3 corpus luteums. In conclusion, when morula and blastocyst were tansplanted into uterine horn, higher pregnancy rate could be achieved iaresh blastocyst or arozen morula was transered. Fresh morula should be transplanted to the receptor with 2～3 corpus luteums on ovary transplantation side instead o1 corpus luteum.

Sheep; Morula; Blastocyst; Frozen embryo; Corpus luteum number oreceptor; Pregnancy rate

S826.3

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-048

2016-09-29；

2017-02-08

转基因重大专项（2014ZX08008-002B、2016ZX08 008-003）；新疆自治区科技支疆项目（2016E02037）；中国农业大学与新疆农业大学合作基金（2015TC050）

徐志远（1989-），男，河北唐山人，硕士，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail: xzy2008331111@163.com

⋆ 通讯作者：刘国世，E-mail: gshliu@cau.edu.cn；赵静，E-mail: wenfa2004@163.com