遮阴胁迫对两种野牛草抗氧化系统的影响

任艺慈， 刘 洁， 李 茂， 陈 晨，孙小玲

(天津农学院园艺园林学院，天津 300384)

在逆境胁迫下，植物体内的活性氧数量剧增，作为应激反应，抗氧化酶活性和抗氧化剂含量会迅速升高，以清除氧自由基，维持细胞内氧自由基的平衡。植株内的抗氧化系统包括两类：酶促清除系统和非酶促清除系统，酶促清除系统包括抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)等；非酶促系统即抗氧化剂，包括抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)、类胡萝卜素和一些含巯基的低分子化合物，如谷胱甘肽等(reduced glutathione, GSH)。而在长期或重度的遮阴胁迫条件下，这种平衡会被破坏，抗氧化酶活性和抗氧化剂含量不再随着胁迫程度的加重而增加，抗氧化系统清除活性氧的能力下降，导致活性氧积累，对细胞造成伤害。如在遮阴初期，Arid3高羊茅(Festucaarundinacea)和沿阶草(Ophiopogonjaponicus)体内MDA含量和抗氧化酶活性(SOD，POD和CAT)均迅速增加，而随着遮阴时间的延长，抗氧化酶活性则又开始降低[5-6]。经过3到4个月的遮阴胁迫处理后，不同遮阴强度的假俭草(Eremochloaophiuroides)抗氧化酶活性均显著降低[7-8]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以Spark野牛草和Texoka野牛草为试验材料，种子由北京绿冠集团提供。2015年5月14日播种在直径18 cm，高15 cm的花盆中，基质为草炭：蛭石=1:1。2016年3月15日选出长势良好的野牛草进行遮阴处理，遮阴梯度包括中光(40%遮阴)、低光 (80%遮阴)以及全光照(无遮阴处理)。试验过程中，定期浇水，保证植物不受水分胁迫。每周浇15 mL的全能Hoagland营养液 (4.373 g NH4NO3·L-1, 2.063 g NaH2PO4·L-1和2.876 g KCl·L-1)，保证植物对养分的基本需求[12]。每个处理6个重复。

1.2 试验方法

H2O2含量的测定参考蔡永萍[13]的方法稍加修改，称取0.2 g新鲜的野牛草叶片，加入5 mL 4℃预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆，3000 r·min-1离心10 min，取1 mL上清液加入0.1 mL 5%的硫酸钛和0.2 mL浓氨水，再以3000 r·min-1离心10 min，弃上清液，沉淀加入5 mL 2 mol·L-1的硫酸，待完全溶解后在415 nm下比色。

MDA和AsA含量，以及SOD、POD和CAT 活性的测定均参考陈建勋和王晓峰[15]的方法并稍加修改。

MDA含量的测定：称取0.5 g新鲜叶片，加入2 mL 5%的三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)研磨匀浆，在3000 r·min-1离心10 min，取上清液2 mL(对照用2 mL蒸馏水)，再加入3 mL 0.5%的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)，混匀后在沸水浴中反应30 min，迅速冷却后离心，取上清液分别于532 nm，600 nm及450 nm波长下测定OD值。MDA含量用如下公式计算：MDA浓度(μmol·L-1)=6.46×(OD532-OD600)-0.56×OD450

AsA含量的测定：称取0.5 g新鲜叶片，加入15 mL 5%的TCA研磨匀浆，在15000 r·min-1离心10 min，取上清液定容至5 mL。取上清液0.2 mL，分别加入0.2 mL 150 mmol·L-1的NaH2PO4(pH 7.4)，0.2 mL H2O，混合均匀，1 min后加入0.4 mL 10%的TCA，0.4 mL 44%的H3PO4，0.4 mL 4%的2,2-二联吡啶溶液，和0.2 mL 3%的FeCl3。混合后37℃中水浴保温1 h，最后测得525 nm处的吸光度值酶液制备：称取0.5 g叶片加入2.5 mL 50 mmol·L-1pH 7.8的磷酸缓冲液(含0.1 mmol·L-1EDTA)，冰浴研磨匀浆，4℃ 8000 r·min-1离心20 min，取上清液用于SOD，POD和CAT活性的测定。

SOD活性测定：3 mL反应体系中含1.5 mL 50 mmol·L-1pH 7.8的磷酸缓冲液，0.3 mL 130 mmol·L-1甲硫氨酸，0.3 mL 750 μmol·L-1氯化硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium, NBT)，0.3 mL 100 μmol·L-1EDTA-Na2，0.3 mL 20 μmol·L-1核黄素，H2O 0.2 mL，最后加入0.1 mL酶液摇匀，在日光灯下反应30 min，测定560 nm处的吸光度值。SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。

POD活性测定：3 mL反应混合液中含0.3%的H2O21 mL， 0.2%愈创木酚0.95 mL，50 mmol·L-1pH 7.0的磷酸缓冲液1 mL, 酶液0.05 mL启动反应，记录1 min内470 nm下光吸收值的变化，POD活性单位以每分钟光密度增加0.01定义为1个活力单位。

CAT活性测定：3 mL反应混合液中含0.3%的H2O21 mL，H2O 1.95 mL，最后加入0.05 mL酶液启动反应，记录3 min内240 nm下光吸收值的变化，CAT活性单位以每分钟光密度减少0.01定义为1个活力单位。

1.3 数据分析

使用SPSS 20.0对试验数据进行单因素方差分析，并用Duncan法进行多重比较，显著性差异水平P<0.05，所有测定值均表示为均值±标准误。由于该试验持续了34天，从3月到4月温度等外部条件变化较大，因此统一以全光照对照为分母，采用相对含量、相对产生速率和相对活性的表示方法。最后以Sigma Plot 10.0作图。

2 结果与分析

2.1 遮荫胁迫对两种野牛草叶片MDA和H2O2的相对含量及相对产生速率的影响

MDA是衡量膜脂过氧化损伤的重要指标。由图1可知，在遮阴处理第5天时，低光处理Texoka和Spark野牛草MDA的相对含量均迅速增加为对照的5.17和5.69倍。中光处理的Texoka和Spark野牛草MDA含量分别为对照的2.71和2.79倍。遮阴处理10天时，低光和中光处理的Spark野牛草的MDA含量回落至对照的2.47和1.84倍，之后便无显著变化；而低光和中光处理的Texoka野牛草在遮阴处理15天后MDA含量又再次达到一个新的更高峰，分别为对照的10倍和4.8倍，遮阴处理20天又回落至对照的1.83和1.66倍，之后则无显著变化。

图1 遮阴胁迫下Texoka和Spark野牛草MDA(A)和H2O2(B)的相对含量以及的相对产生速率Fig.1 The relative content of MDA (A) and H2O2 (B), and the relative production rate of (C) in leaves of Texoka and Spark buffalograss under shading stress

2.2 遮荫胁迫对两种野牛草叶片SOD，POD，CAT活性和AsA含量的影响

POD和CAT同为清除H2O2的关键酶。低光和中光处理的Spark野牛草POD的相对活性在遮阴过程中出现了两次高峰，第一次是遮阴处理第15天时，分别为对照3.91和2.41倍；第二个高峰出现在遮阴处理第27天时，峰值不及第一次高峰(图2)。Texoka野牛草POD的相对活性第一个高峰出现的时间与Spark野牛草相似，低光处理的Texoka野牛草POD的峰值稍高于低光处理的Spark野牛草(图2)。同SOD相似，Spark野牛草CAT的相对活性出现高峰的时间比Texoka野牛草更迟。如图2所示，低光和中光处理的Texoka野牛草在遮阴处理第10天时CAT的相对活性达到顶峰，分别为对照的4.12和3.81倍。低光和中光处理的Spark野牛草CAT的相对活性分别在遮阴处理第15天和20天时达到顶峰，分别为对照的4.94和3.52倍。

图2 遮阴胁迫下Texoka和Spark野牛草的SOD(A)，POD(B)和CAT(C)的相对活性及AsA(D)的相对含量Fig.2 The relative activities of SOD(A), POD(B), CAT(C), and the relative content of AsA (D) in leaves of Texoka and Spark buffalograss under shading stress

3 讨论与结论

3.1 野牛草抗氧化反应系统的特点

植物受到逆境胁迫时，内源H2O2含量会迅速升高，促使植物体内的抗氧化系统活性增强以抵御逆境胁迫[16]。在本研究中，低光和中光处理的Spark野牛草H2O2的相对含量出现高峰的时间比Texoka野牛草更迟，但峰值更高(图1B)，这一响应与SOD、CAT和AsA的响应相似(图2)，说明在Spark野牛草中H2O2含量的增高有效的促进了抗氧化酶(SOD和CAT)活性的增高和抗氧化物(AsA)含量的增加。Spark野牛草H2O2的相对含量峰值虽然稍高于Texoka野牛草，但H2O2还有一个作用是需要在生长素信号通道和氧化还原作用的信号通道之间做出灵活的响应，因此不能简单的以H2O2的浓度判断植物受胁迫的程度[17]，且有报道表明，植物可以耐受高浓度的H2O2(102～2×105μmol·L-1)[18]。可见植物抗氧化反应系统设计的目的是为了控制细胞氧化还原电位的状态，而不是将H2O2完全清除。

抗氧化酶系统是一个容易随外界变化而改变的复杂系统，一般呈现先升后降的变化趋势，因为超出细胞的承受能力之后，环境胁迫的时间延长和强度加大造成细胞膜脂过氧化程度的加深和细胞伤害增强，影响了细胞内蛋白质等物质的合成，导致抗氧化酶活性降低[10]。在本研究中其活性变化也是非线性的，除了“先升后降”的变化趋势之外，后续还会出现几个小高峰(图2A，2B，2C)。这是因为植物对逆境的应答不止包括抗氧化系统，还与植物的其它系统和分子应答机制相关联。如热休克应答对抗氧化酶的保护作用，在高温和重金属胁迫条件下，热激蛋白的转录和翻译增强，作为分子伴侣其可以防止蛋白聚集，对抗正常的细胞死亡，因此才会出现抗氧化酶活性下降又上升的情况[4]。

Spark野牛草POD活性的峰值出现在遮阴处理第15和27天(图2B)，CAT活性的峰值出现在遮阴处理第15和20天(图2C)，AsA含量的峰值出现在遮阴处理第15和34天(图2D)。CAT和POD为清除H2O2的抗氧化酶，而AsA是植物体内清除H2O2重要的非酶促系统。在一定强度的环境胁迫下，这些酶促和非酶促系统之间的互补作用可以保证无论H2O2浓度高低，都可以高效将其清除[19]。

3.2 Spark野牛草的耐阴性优于Texoka野牛草

在长达34天的遮阴胁迫处理下，Spark野牛草的表现优于Texoka野牛草。无论中光还是低光处理，Spark野牛草MDA的相对含量均较低。如前所述抗氧化系统一般呈现先升后降的变化趋势，因此可以通过胁迫处理过程中抗氧化酶活性或抗氧化剂含量拐点的胁迫条件推测植物耐受胁迫的时间和能力[10]。Spark野牛草SOD，CAT活性和AsA含量最高峰出现的时间均比Texoka野牛草推迟5～10天，而峰值则高于相同遮阴梯度处理的Texoka野牛草。这些结果说明Spark野牛草可以通过提高抗氧化酶活性和抗氧化剂含量的方式减少膜脂过氧化的伤害，其耐阴性要优于Texoka野牛草。

3.3 Spark野牛草较高的AsA含量帮助其对抗遮阴胁迫

APX主要存在于叶绿体基质中，是清除叶绿体中抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环所产生的H2O2的关键酶。且APX与H2O2的亲和力较强，而AsA是APX专一的电子供体。除此之外，AsA还是植物体内主要的抗氧化剂，存在于所有组织中，尤其以光合细胞叶绿体周围浓度最高。外源AsA可缓解环境胁迫对植物的伤害，例如外源AsA可减缓镉对蒜(Alliumsatvium)根生长的毒害[21]。AsA可以自身合成，也可以通过AsA-GSH循环系统再生。抗坏血酸有3种存在形式，还原型抗坏血酸(AsA)，单脱氢抗坏血酸(monodehydroascorbate, MDHA)和脱氢抗坏血酸(dehydroascorbate, DHA)，但由于DHA不稳定，90%以上的抗坏血酸以AsA的形式存在[22]。AsA的氧化还原状态反映了植物受胁迫的情况，例如适度的干旱胁迫时苹果树(Malusdomestica)叶片内AsA含量升高，而重度的干旱胁迫时AsA含量下降[23]。低光处理的Texoka野牛草只在遮阴处理第10天时AsA的相对含量有一个高峰，也仅为对照的5.16倍，此后便降为对照的1.32倍，且再无显著的增长，再次说明低光处理对Texoka野牛草造成了不可逆转的伤害。低光处理的Spark野牛草在遮阴处理第34天时AsA含量增长为对照的8.28倍(图2D)，H2O2含量也随即回落到对照的1.12倍水平(图1B)。因此我们认为相对于Texoka野牛草，Spark野牛草中的AsA无论是作为抗氧化剂，还是作为APX的电子供体，维持APX活性，都是清除H2O2的重要物质，在保护膜系统方面起了关键性的作用。