基于化学表征和生物效价检测的大黄配方颗粒质量评价研究

谭鹏　张海珠　张定堃　伍珊娜　牛明　王伽伯　肖小河

[摘要]该文尝试将多指标成分同时定量分析和生物效价分析方法联合使用的模式应用于中药配方颗粒的质量评价，并以大黄配方颗粒为模式药进行了示范性研究。采用超高效液相色谱法同时测定大黄配方颗粒中芦荟大黄素8OβD葡萄糖苷等10个蒽醌类化学成分的含量；在复方地芬诺酯片致小鼠便秘模型上，测定不同批次大黄配方颗粒致泻生物效价；在体外抗大鼠血小板聚集模型基础上，测定不同批次大黄配方颗粒的活血生物效价；采用SPSS统计软件对测定的10个蒽醌类化学成分与致泻、活血生物效价之间的相关性进行统计学分析。多指标化学含量测定结果显示10个批次间大黄配方颗粒的化学表征差异较大，与此同时，致泻、活血生物效价均存在一定的差异性；相关性分析结果显示大黄配方颗粒的致泻生物效价强弱和其含有的结合型蒽醌糖苷类成分的含量有显著相关性（P<001），活血生物效价的强弱和其含有的游离型蒽醌成分的含量有显著相关性（P<001）。综上，采用多组分化学表征和生物效价检测联用的模式可以客观量化、更全面的反映不同批次大黄配方颗粒的整体质量差异。

[关键词]大黄配方颗粒； 质量评价； 生物效价； 多组分化学表征； 相关性分析

[Abstract]This study attempts to evaluate the quality of Chinese formula granules by combined use of multicomponent simultaneous quantitative analysis and bioassay The rhubarb dispensing granules were used as the model drug for demonstrative study The ultrahigh performance liquid chromatography （UPLC） method was adopted for simultaneously quantitative determination of the 10 anthraquinone derivatives （such as aloe emodin8OβDglucoside） in rhubarb dispensing granules； purgative biopotency of different batches of rhubarb dispensing granules was determined based on compound diphenoxylate tabletsinduced mouse constipation model； blood activating biopotency of different batches of rhubarb dispensing granules was determined based on in vitro rat antiplatelet aggregation model； SPSS 220 statistical software was used for correlation analysis between 10 anthraquinone derivatives and purgative biopotency， blood activating biopotency The results of multicomponents simultaneous quantitative analysisshowed that there was a great difference in chemical characterizationand certain differences inpurgative biopotency and blood activating biopotency among 10 batches of rhubarb dispensing granules The correlation analysis showed that the intensity of purgative biopotency was significantly correlated with the content of conjugated anthraquinone glycosides （P<001）， and the intensity of blood activating biopotency was significantly correlated with the content of free anthraquinone （P<001） In summary， the combined use of multicomponent simultaneous quantitative analysis and bioassay can achieve objective quantification and more comprehensive reflection on overall quality difference among different batches of rhubarb dispensing granules

[Key words]rhubarb dispensing granules； quality evaluation； biopotency； multicomponent simultaneous quantitative analysis； correlation analysis

中藥配方颗粒是按照传统中药汤剂煎煮的方式，采用现代制药技术将单味中药饮片经提取、浓缩、干燥等工艺制成的单味中药产品，具有不需煎煮、服用方便等优点[1]。但由于存在生产工艺不统一、质量标准与临床疗效脱节等问题[23]，导致中药配方颗粒的质量良莠不齐，无法保障临床疗效，所以国家目前对中药配方颗粒仅实行试点生产，究其主要原因是缺少一些可全面有效地评控中药配方颗粒的质量的评价方法[45]。现有文献显示[67]，化学指纹图谱法是目前中药配方颗粒的主要评控方法，但是越来越多的药学研究者意识到仅仅通过指标性成分含量测定或化学指纹图谱方法无法全面表征其整体质量，也无法关联其临床疗效。

近年来，生物活性评价方法已逐渐受到国内外学者的关注，尤其是2015年FDA发布的《植物药研发行业指南》对植物药及制剂的质量评控明确提出[8]：在只靠化学检验不足以确保质量和疗效一致性的情况下，应在植物药原料药和/或药品放行质量标准和稳定性方案中纳入生物检定，并以反映药物已知或预期作用机制的生物检定为首选。肖小河等指出[910]，生物活性检测方法联合多组分化学表征将是中药及中药相关产品质量评控的重要发展方向。

根据2015年版《中国药典》，大黄配方颗粒的原药材有3个基原：蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L、唐古特大黄R tanguticum Maximex Balf或药用大黄R officinale Baill的干燥根和根茎[11]，具有泻下通便、活血化瘀、利湿退黄等多种功效。作为典型的多基原、多功效中药，如何全面、有效地评价大黄配方颗粒在不同功效用途中的品质优劣，将关乎其临床疗效的有效性和稳定性。在课题组前期研究基础上[1214]，本研究尝试将多组分化学表征和生物效价检测联用模式示范性应用于大黄配方颗粒的质量评价，以期为中药配方颗粒的质量评价提供一种参考研究模式和分析方法。

1材料

11仪器

Waters Acquity超高效液相色谱仪（Waters，USA），配备自动进样器，光电二极管阵列检测器，Empower 2色谱工作站；XS205电子天平（Mettler Toldeo，Switzerland），AL204电子天平（Mettler Toldeo，Switzerland），超声仪（南京新辰生物科技有限公司，500 W，40 KHz），MilliQ超纯水制备系统（Millipore，USA）；Aggram血小板聚集分析仪（Helena，USA）；配备镭射光学系统，四通道，镀硅的硼硅玻璃比色管（767 mm×60 mm）；台式低速大容量离心机（L550，湖南湘仪离心机仪器有限公司），27 mL一次性真空采血管（含有0109 mol·L-1枸橼酸钠，美国BD公司）；采血针（批号150809，天津哈娜好医材有限公司）。

12动物

ICR雄性小鼠，SPF级，体重19～22 g；SD雄性大鼠，SPF级，体重240～260 g，动物许可证号：SCXK（军）20120004，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

13试药

芦荟大黄素8OβD葡萄糖苷（纯度9861%），大黄酸8OβD葡萄糖苷（纯度9835%），大黄酚8OβD葡萄糖苷（纯度9842%），大黄素8OβD葡萄糖苷（纯度9845%），大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷（纯度9841%），芦荟大黄素（纯度9849%），大黄酸（纯度9908%），大黄素（纯度9911%），大黄酚（纯度9987%），大黄素甲醚（纯度9920%），番泻苷A（纯度9901%），均由成都普菲德生物科技有限公司提供。色谱级甲醇、色谱级磷酸（85%，Thermo Fisher Scientific，USA），ACS级Dimethyl sulfoxide （DMSO，AMRESCO）。苯巴比妥钠（Sigma公司），腺苷二磷酸（ADP，购买于美国Helena Lab，批号215551189）。复方地芬诺酯片（批号1406001，常州康普药业有限公司），10批次大黄配方颗粒由北京康仁堂提供，具体信息见表1。

2方法与结果

21大黄配方颗粒中10个蒽醌类化学成分含量测定[12]

211色谱条件

Waters BEH C18色谱柱 （21 mm×100 mm，17 μm），以甲醇（A）和01%磷酸水溶液（B）的混合溶液为流动相，梯度洗脱（000～500 min，39%～42% A；501～700 min，42%～51% A；701～1200 min，51%～56% A；1201～1500 min，56%～70% A；1501～1700 min，70%～77% A；1701～2100 min，77%～78% A；2101～2500 min，78%～88% A）；体积流量为020 mL·min-1，检测波

长410 nm，进樣量2 μL，柱温30 ℃，柱平衡时间 5

min，理论塔板数以大黄素峰计算不得低于7 000。

212对照品溶液的制备

精密称取芦荟大黄素8OβD葡萄糖苷等10个对照品适量，置于50 mL棕色量瓶中，先用40 mL DMSO溶解，再用色谱级甲醇稀释至刻度，配制成浓度为700～3500 mg·L-1的混合对照品溶液，4 ℃储存备用。

213供试品溶液的制备

准确称取大黄配方颗粒细粉（过4号筛）050 g，置于50 mL棕色量瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定质量，超声处理60 min，再称定质量，用甲醇补足失重，摇匀，用022 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

214方法学验证

按照2015年版《中国药典》四部关于药品质量标准分析方法验证指导原则和国际药品技术要求协调组织的指导方针（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Huaman Use，ICH Q2B）进行方法学考察[1516]。

2141线性关系考察精密吸取上述混合对照品溶液02，04，08，10，20，40 μL注入超高效液相色谱仪进行测定，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（y），进样量（μg）为横坐标（x），绘制标准曲线。结果表明10个化学成分在一定浓度范围内的线性关系较好，结果见表2。

表2线性关系和灵敏度分析

Table 2Linearity and sensitivity of the UPLC analysis

化学成分线性方程R2线性范围/mg·L-1检测限/mg·L-1定量限/mg·L-1

芦荟大黄素8OβD葡萄糖苷y=53×106x-24 0650999 2400～8000050200

大黄酸8OβD葡萄糖苷y=54×106x-30 7720999 1480～12000060240

大黄酚8OβD葡萄糖苷y=49×106x-2 9840999 3672～8400084336

大黄素8OβD葡萄糖苷y=48×106x-5 6930999 4600～4000100300

大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷y=55×106x-4 0190999 1400～4000080200

芦荟大黄素y=99×106x-9 9730999 6400～4000080200

大黄酸y=89×106x-9 2440999 5400～4000080200

大黄素y=75×106x-5 7120999 4600～7200100300

大黄酚y=10×107x+4091000600～6400103300

大黄素甲醚y=92×106x-1 4371000540～3000090270

2142检测限和定量限考察检测限和定量限用来评估方法的灵敏性，本实验中采用直观法。用上述已知浓度的对照品溶液不断稀释，直至试验出能被可靠地检测出和定量检测的最低浓度，结果见表2。

2143精密度考察取上述混合对照品溶液，连续进样6次，进样量为2 μL，记录目标化合物的色谱峰面积，计算RSD。结果显示芦荟大黄素8OβD葡萄糖苷，大黄酸8OβD葡萄糖苷等10个化学成分峰面积的RSD为14%，16%，19%，19%，30%，21%，12%，24%，10%，15%，表明仪器的精密度良好。

2144稳定性考察取同一供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，16，24 h时进样测定，记录各目标化合物的峰面积，计算RSD。结果显示，芦荟大黄素8OβD葡萄糖苷，大黄酸8OβD葡萄糖苷等10个化学成分在24 h内色谱峰面积的RSD分别为20%，24%，19%，25%，19%，14%，20%，25%，24%，17%，表明在24 h内供试品溶液的稳定性良好。

2145重复性考察取同一批次（批号14009802）的大黄配方颗粒粉末，共称取6份，每份050 g，精密称定，按照上述方法制备供试品溶液。精确吸取6份供试品溶液各20 μL注入超高效液相色谱仪进行测定，平行测定2次，记录目标化合物色谱峰面积，计算含量。结果显示6份供试品中10个化学成分质量分数平均值为109，025，326，025，036，022，019，013，049，011 mg·g-1，表明方法的重复性良好。

2146准确度考察取同一批次（批号14009802）已知含量的大黄配方颗粒样品粉末025 g，置于50 mL棕色量瓶中，分别加入相等质量的对照品物质（以各化合物的对照品单标溶液形式加入），最后加入一定量甲醇溶液至总量为25 mL，按照上述法制备供试品溶液，进样测定，计算含量和回收率，结果见表3。结果表明10个化学成分的回收率在9613%～1049%；表明方法的准确性较好。

215供试品溶液的分析

精密吸取对照品溶液和供试品溶液20 μL注入超高效液相色谱仪分析，记录色谱峰面积，按照外标法计算各目标化学成分的含量。典型UPLCUV见图1，测定结果见表4。

22大黄配方颗粒致泻效价的测定[1213]

221参照物溶液的制备

准确称取番泻苷A对照品130 mg，准确加入温度为37 ℃的01%NaHCO3热水52 mL溶解备用，保持药液温度37 ℃，给药时摇匀。

222供试品溶液的制备

准确称取各批次大黄配方颗粒10 g，用50 mL 37 ℃热水溶解，超声处理5 min，按照剂间比08进行稀释，得到4个不同给药浓度。

223供试品致泻效价的测定

取复方地芬诺酯片60片置于研钵研为细粉，加37 ℃热水90 mL溶解，超声20 min，备用，给药时摇匀。ICR雄性小鼠130只，体重（20±3）g，分为13组，每组10只，实验前12 h禁食不禁水。其中第1组作为正常组，不給与任何造模和给药；第2组作为模型对照组，仅仅给与复方地酚诺酯片造成便秘模型；第3组作为阳性对照组，给与复方地酚诺酯片混悬液造成便秘模型，再给与番泻苷A水溶液灌胃；其余10组分别对应10批次配方颗粒水溶液给药。先用复方地酚诺酯片混悬液（剂量60 mg·kg-1）灌胃进行造模，造模1 h后灌胃给药，给药量04 mL/只，给药后禁食不禁水，8 h后收集粪便质量，置于干燥洁净EP管内，准确称定质量。根据简化概率

单位法原理计算致泻效价[17]。将给药剂量和粪便质量输入生物效价量反应计算软件，计算致泻效价和效价的可信限率（FL），结果见表5。

测定结果显示，10个批次大黄配方颗粒的致泻生物效价在371～1301 U·g-1，后者是前者的35倍，表明不同批次大黄配方颗粒致泻生物效价差异较大。

23大黄配方颗粒活血效价的测定[18]

231乏血小板血浆（PPP）和富血小板血浆（PRP）的制备

取体重为240～260 g的SD雄性大鼠，先用苯巴比妥钠（60 mg·kg-1）麻醉，再用真空采血管从腹主动脉取血。采血管立即置于离心机内，在转速为800 r·min-1、温度为20 ℃模式下离心15 min，小心吸取上清液置于洁净的5 mL EP管内；剩余血液重复操作1次，小心吸取上清液置于前述EP管内，得到富血小板血浆（plateletrich plasma，PRP）；剩余血液在转速为3 000 r·min-1、温度为20 ℃模式下离心30 min，小心吸取上清液置于另一支5 mL EP管内，得到乏血小板血浆（plateletpoor plasma，PPP），备用。PRP和PPP需要保持在18～25 ℃，并尽量不要扰动。

232诱导剂的制备

每瓶含有200 μmol·L-1的腺苷二磷酸（ADP），准确加入去离子水1 mL溶解，轻轻摇匀，作为诱导剂储备液。吸取适量储备液用生理盐水按照1∶3的比例稀释储备液，作为诱导剂工作液。复溶后的储备液保存在2～6 ℃可稳定一周或在-80 ℃下可保存3个月。工作液应在制备后2 h内使用。

233对照品溶液和供试品溶液的制备

准确称取编号为yp8的大黄配方颗粒10 g，分別用50 mL 37 ℃热水溶解，超声处理5 min，作为对照品溶液备用。同法制备其他批次的溶液，作为供试品溶液备用。

234血小板聚集率的测定

大黄配方颗粒对照品溶液和供试品溶液按剂间比08用空白PPP进行稀释，得到4个不同给药浓度。按照（4，4）法分别测定对照品组和供试品组的血小板最大聚集率（Max），每组平行测定2次。具体操作如下：血小板聚集仪提前开机预热30 min，待预热完成后，先用PPP样本400 μL进行透光度调零，每根玻璃比色管分别加入PRP 125 μL和含药PPP 100 μL混匀（空白组加入不含药的PPP），加入一粒搅拌子，把比色管放入预热通道内37 ℃环境下预热3 min，再将玻璃比色管放入经过调零后的检测通道内，准确加入ADP诱导剂工作液25 μL，迅速按下检测按钮进行检测，记录聚集波形和最大聚集率。检测时限应在血液采集后2 h内完成，检测室温环境应保持在18～25 ℃。

235大黄配方颗粒活血效价的计算

由于有拮抗血小板聚集的药物存在，相对于空白组而言，含药组血小板最大聚集率会降低，由此可以计算得到测试药物对血小板聚集过程的最大抑制程度，即抑制率。抑制率=（空白组最大聚集率-给药组最大聚集率）/空白组最大聚集率×100%。

根据简化概率单位法原理计算活血效价[17]。由于目前尚无用于活血生物效价检测的大黄配方颗粒对照品，实验中对大黄配方颗粒标准参照物（yp1）进行原始效价赋值，定义其效价为1万 U·g-1，计算不同批次大黄配方颗粒的活血效价和效价的可信限率（FL），结果见表6。

测定结果显示，10个批次大黄配方颗粒的活血生物效价在6 329～13 928 U·g-1，后者是前者的22倍，表明不同批次间大黄配方颗粒的活血生物效价存在一定的差异。

24相关性分析

为了探究大黄配方颗粒中10个蒽醌类化学成分与实际测得泻下、活血效价强弱的相关性，采用统计学软件SPSS 220对测得的10个化学成分含量和大黄配方颗粒的实际测得泻下、活血效价作相关性分析，以相关系数（r）作为评价指标，相关性分析结果见图2。

相关性分析结果显示，大黄配方颗粒中的结合型蒽醌糖苷的含量多寡与泻下生物效价的高低具有较好的相关性（r=083），而总游离蒽醌的含量与泻下生物效价的高低几乎没有相关性（r=007）；与之相反，大黄配方颗粒中游离蒽醌的含量多寡与活血生物效价的高低具有较好的相关性（r=078），而总蒽醌糖苷的含量与活血生物效价高低的相关性较小（r=018）。结果表明了结合型蒽醌糖苷类成分对大黄配方颗粒的泻下通便作用贡献较大，而游离蒽醌类成分对活血化瘀作用的贡献较大，这与课题组前期研究结果相符合[18]。相关性分析结果提示，利用多指标化学表征方法评控大黄配方颗粒的质量，应选择与功效相关（以临床功效为导向）的药效物质作为评价指标。

3讨论

现代研究表明，活血化瘀中药主要通过抑制血栓形成、改善血流动力学、血液流变学等过程发挥其活血化瘀作用[19]。不可否认，拮抗血小板聚集只是药物发挥活血化瘀功效的一部分作用机制，不能完全代表活血化瘀的整体作用，但血小板聚集功能是线性拟合曲线；95%置信区间；预测区间。

影响机体止血/活血过程的重要因素之一，而血小板聚集性是反应血小板功能的重要指标。比浊法作为一种体外评价血小板聚集功能的检测方法，已经广泛应用于临床检验，被认可为检测血小板聚集作用的“金标准”[2021]。利用体外抗血小板聚集已经应用于川芎、赤芍、三七、舒络胶囊等中药及中药复方制剂的活血化瘀作用的评价[2223]。本实验在体外抗血小板聚集的基础上，进一步引入质反应计算软件，定量计算拮抗活血效价值，可更加直观的表征不同药物拮抗血小板聚集作用的强弱。

由于大黄配方颗粒的原材料来源各异，对其进行质量一致性评价对于临床用药的疗效一致性和有效性具有重要意义。在本实验中，从多组分化学定量测定结果来看，化学表征存在一定的差异性；从生物效价测定结果来看，不同批次间大黄配方颗粒的致泻生物效价和活血生物效价也存在较大的差异。这就表明了，化学定量测定仅仅只是对大黄配方颗粒在某一特定紫外吸收波段下的化学表征，并不能全面表征其质量差异，而致泻生物效价和活血生物效价从2个不同的功效作用强度反映其质量差异，是对大黄配方颗粒质量直接关联临床功效的整体表征。从相关性分析结果来看，致泻生物效价的强弱和大黄配方颗粒中的结合型蒽醌糖苷的含量多寡具有显著相关性（P<001），而活血生物效价的强弱和游离型蒽醌的含量多寡有显著相关性（P<001），这表明了在现阶段以化学成分定量测定为主要评控手段和模式下，尽可能多的定量测定配方颗粒中关联功效的活性成分对其质量一致性控制具有重要意义。

中药配方颗粒由于已经经过提取、浓缩、制粒、干燥等加工工艺，其本身与原药材已有很大差异，传统的显微鉴别、性状鉴别等质量评控方法已经无法对其进行质量评控。化学指纹图谱分析方法在一定程度上可以表征质量的波动，但这也仅仅是在某一紫外吸收波段下的化学表征，具有模糊性和不确定性的劣势，也不能直接、客观量化的表征其整体质量。生物活性评价方法既能关联临床功效，又具有实际可操作性，在中药配方颗粒的质量评控中具有独特的优势。2015年12月24日国家食品药品监督管理总局发布的《中药配方颗粒管理办法（征求意见稿）》第十四条中明确指出“中药配方颗粒药品标准的制定，加强专属性鉴别和多成份、整体质量控制，充分反映现阶段药品质量控制的先进水平和质量源于设计的理念”。本文首次尝试将多指标化学成分定量测定和关联临床功效的生物效价检测联用模式应用于中药配方颗粒的质量评价，并以大黄配方颗粒为模式药进行了示范性研究，对其他中药配方颗粒的质量评控具有一定的参考价值。

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[责任编辑孔晶晶]