含挥发油饮片桂枝饮片标准汤剂质量标准的建立及探讨

邓哲　冯伟红　章军　焦梦姣　张国瑗　王淑慧　程锦堂　刘安

[摘要]制备桂枝饮片标准汤剂并建立质量标准，为配方颗粒等临床非传统用药形式提供质量参照，同时也为含挥发油的饮片标准汤剂研究提供參考。从市场上收集14批不同质量的桂枝饮片，在中药饮片标准汤剂制备原则基础上进一步完善提取工艺，制备桂枝饮片标准汤剂，计算出膏率、桂皮醛的转移率、pH等参数，评价工艺稳定性；建立指标成分含量测定方法和特征图谱。结果表明桂枝饮片标准汤剂的出膏率为606%～895%，平均出膏率为718%；桂皮醛转移率为296%～543%，平均转移率为432%；pH 433～482。14批桂枝饮片标准汤剂特征图谱与对照特征图谱相似度均>09。该研究建立的制备方法稳定、质量标准完善，适用于桂枝饮片标准汤剂质量评价。

[关键词]桂枝饮片； 挥发油； 标准汤剂； 质量标准

[Abstract]To prepare Cinnamomi Ramulus pieces standard decoction and establish its quality standard， provide quality reference for formula granules and other clinic nontraditional forms of medicines， and lay a foundation for standard decoction research for the pieces containing essential oil 14 batches of Cinnamomi Ramulus pieces with different quality were collected from market and their extraction process was further improved based on the preparation principle of standard decoction to prepare the standard decoction of Cinnamomi Ramulus pieces Then its transfer rate of Cinnamaldehyde， dry extract rate and pH value were calculated to evaluate its process stability； and a method for chromatographic fingerprint and content determination was also established Results revealed that the dry extract rate for standard decoction of Cinnamomi Ramulus pieces was from 606%895%， with an average value of 718%； the transfer rate of cinnamaldehyde was at the range of 296%543%， with an average of 432%； and the pH value was at the range of 433482 The fingerprint similarities between 14 batches of standard decoction of Cinnmomi Rammulus pieces and reference fingerprint were all>09 The established method for standard decoction was stable and its quality standard was perfect， suitable for evaluating the quality of standard decoction of Cinnanomi Ramulus pieces

[Key words]Cinnamomi Ramulus pieces； volatile oil； standard decoction； quality standard

中药饮片标准汤剂是以中医理论为指导、临床应用为基础，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂，用于标化临床用药，保障用药的准确性和剂量的一致性[1]。中药标准汤剂作为一种标准物质和标准体系，可以标化所有以水为溶媒的包括配方颗粒在内的新型用药形式。它能够有效的解决配方颗粒标准不统一而导致配方颗粒市场“乱”相的问题[2]。2016年8月5日国家药典委起草的“中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）”也明确提出中药配方颗粒的所有药学研究均须与标准汤剂进行对比，以保证与标准汤剂质量一致性。

桂枝来源于樟科植物肉桂Cinnamomun cassia Presl的干燥嫩枝。其辛、温、甘，归心、肺、膀胱经，具有发汗解肌、温通经脉、助阳化气、平冲降气之功效[3]。临床多用于风寒感冒、脘腹冷痛、血塞经闭、关节痹痛、痰饮、水肿、心悸等症。现代药理研究表明它有抑菌、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒、利尿、解热、镇痛、扩张血管等多种药理活性[4]。桂枝主要含有挥发性成分、有机酸类、香豆素类等化学成分，其中以桂皮醛为主的挥发性成分是其发挥药效的物质基础。据统计，它是《伤寒论》中继甘草临床应用第二多的药物。结合文献，有关标准汤剂研究的报道主要集中在不含挥发油的中药饮片上，如黄芩[5]、甘草[6]、白芍[7]、人参[8]、红花[9]、葛根[10]等。而对于含挥发油、指标成分水溶性差的饮片鲜有文章报道。本文开展了桂枝饮片标准汤剂质量标准研究，以期为含挥发油类成分的中药饮片标准汤剂研究提供参考。

1材料

11仪器与试剂

Waters Alliance高效液相色谱仪（美国Waters公司，2695四元溶剂管理器，2996二极管阵列检测器，Empower 3色谱工作站），XS205型1/10万电子分析天平（瑞士，梅特勒托利多仪器有限公司）；KQ250 DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；桂皮醛对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，经HPLC面积归一化法测定，纯度> 98%，批号CHBG029），甲醇、乙腈均为HPLC级（美国，Fisher公司），水为娃哈哈纯净水，其他试剂为均分析纯。

12样品

本研究共收集了14批桂枝饮片，其来源于市场上7家中药饮片企业，包含3个不同产地及不同品质的饮片。经DNA条形码鉴定，14批样品均为樟科植物肉桂C cassia的干燥嫩枝。其具体信息见表1。

2方法与结果

21桂枝饮片桂皮醛含量测定

按照2015年版《中国药典》方法测定14批桂枝饮片中桂皮醛的含量，见表2。结果表明14批桂枝饮片均符合桂皮醛不得少于10%的限量要求。

22桂枝饮片标准汤剂的制备

将符合药典标准的饮片，在《中药标准汤剂研究策略》一文中建议枝干皮藤类煎煮工艺的基础上，稍作改进，进行桂枝饮片标准汤剂的制备。其具体工艺参数为：取桂枝饮片100 g，加8倍量的水浸泡30 min后，置挥发油提取器中提取2 h，接出挥发油，水提液滤过，药渣再加7倍量的水，于挥发油提取器中继续提取30 min，接出挥发油，水提液滤过。合并2次水提液，浓缩至适量，合并2次提取的挥发油，加入浓缩液中，并加入适量的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80），混匀，定容至500 mL，摇匀，得到规格为02 g·mL-1的桂枝饮片标准汤剂。

23桂枝饮片标准汤剂中桂皮醛含量测定

231色谱条件Chromegabond WR C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），乙腈（A）水（B），梯度洗脱（0 ～ 30 min，10% ～ 40% A；30 ～ 45 min，40% A），柱温30 ℃，流速1 mL·min-1，检测波长290 nm，进样量10 μL。在此条件下，供试品溶液中的桂皮醛与其他成分分離良好，见图1。

232对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h的桂皮醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含24 μg的溶液，即得。

233供试品溶液的制备取桂枝饮片标准汤剂摇匀，精密吸取量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过022 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

234线性关系考察精密吸取232项下的桂皮醛对照品溶液02，2，3，4，5，6，7，8，9 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，按231项下方法进样，测定桂皮醛的峰面积，以桂皮醛的进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，得到回归方程Y=108×107X+325×104，R2= 0999 9，线性范围0024 0～108 μg。

235精密度试验取同一桂枝饮片标准汤供试品溶液，按231项下色谱条件方法连续进样6次，计算供试品溶液中桂皮醛的峰面积的RSD为020%，表明仪器精密度良好。

236重复性试验平行制备6份桂枝饮片标准汤剂供试品溶液，按231项下色谱条件进样，结果桂枝饮片标准汤剂中桂皮醛的平均含量为083 g·L-1，RSD 为11%，表明该方法的重复性良好。

237稳定性试验取桂枝饮片标准汤剂供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0，2，4，8，12，24 h按231项下色谱条件测定，计算桂皮醛的峰面积的RSD为030%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定。

238加样回收试验取已知含量的桂枝饮片标准汤剂（099 g·L-1），根据标准汤剂中桂皮醛的含量按约1∶1的量添加桂皮醛对照品（0495 9 mg），平行制备6份供试品溶液，按231项下色谱条件进行试验，计算供试品溶液中桂皮醛的平均加样回收率为9520%，RSD为045%，表明该方法的准确度较好。

239样品测定精密吸取对照品溶液20 μL、桂枝饮片标准汤剂供试品5 μL按231项下色谱条件测定，按外标一点法计算桂皮醛含量，测定14个批次，每批次平行2份，结果见表2。

24桂枝饮片标准汤剂转移率计算及其他参数测定

241转移率计算以桂皮醛为指标，计算其转移率，得出桂皮醛转移率为296%～543%，平均转移率为432%，结果见表2。

242其他参数测定pH用pH计（sartorius PB10）测定，pH 433～482，结果见表2。出膏率取桂枝饮片标准汤剂适量，摇匀，精密吸取10 mL置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，称定质量，每批平行2份，出膏率为606%～895%，平均出膏率为718%。结果见表2。

25特征图谱的建立

251色谱条件同231项色谱条件，稍有不同是特征图谱检测波长为254 nm。

252供试品溶液制备同233项下供试品溶液制备方法。

253精密度试验取同一批桂枝饮片标准汤剂（GZ09）供试品溶液，按231项下方法连续进样6次，以桂皮醛峰（7号峰）为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明各峰相对保留时间RSD<01%，相对峰面积RSD<20%，表明仪器精密度良好。

254重复性试验平行制备6份桂枝饮片标准汤剂（GZ09）供试品溶液，按231项下方法进样，测定桂枝标准汤剂供试品溶液中各特征峰的保留时间和峰面积。以桂皮醛峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明各峰相对保留时间的RSD<030%，相对峰面积的RSD<20%，表明该方法的重复性较好。

255稳定性试验取桂枝饮片标准汤剂（GZ09）供试品溶液，分别于供试品溶液制备后第0，2，4，8，12，24 h按231项下方法进样测定，以桂皮醛为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果各峰相对保留时间的RSD<020%，相对峰面积的RSD<19%，表明桂枝标准汤剂供试品溶液在24 h内稳定。

256样品检测与分析分别取14批桂枝饮片标准汤剂，按233项下方法制备供试品溶液，再按251项下色谱条件分别测定，记录HPLC图，见图2。将14批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A），采用中位数法，时间窗为01，进行相似度计算，见图3，表3。结果发现14批桂枝饮片标准汤剂与对照特征图谱相似度均>09，表明各批次桂枝饮片标准汤剂具有较好的一致性。

26工艺稳定性验证

取同一批饮片样品（GZ09），按22项下桂枝饮片标准汤剂制备方法平行制备3份标准汤剂试样，分别按233项下供试品溶液制备方法制备供试品，依照231项下色谱条件测定桂枝饮片标准汤剂中桂皮醛的含量，计算转移率，并进行其他参数的测定。3次试验中桂皮醛的平均质量分数为1012 g·L-1，RSD为95%；平均转移率为464%，

3讨论

31不同品质的样品

本研究收集了广西、广东、湖北3个产地的桂枝饮片，以广西居多，其中广西既是道地产区也是主产区。同时这些桂枝饮片来源于7个几乎分散全国的不同厂家，包含有不同规格、不同生产日期的饮片。所研究的样品基本能代表市场上所有流通的桂枝饮片。

32供试品处理考察

对桂枝饮片标准汤剂前处理重点考察了溶劑种类和稀释倍数。溶剂种类中考察了纯水、无水乙醇、甲醇3种溶媒，结果发现甲醇处理效果最优，测得的桂皮醛含量最高。稀释倍数考察了5，10，25，50倍，不同稀释倍数，桂皮醛含量接近，10倍稍高点，因此选择稀释10倍。所以桂枝饮片标准汤剂前处理为取1 mL样品，用甲醇稀释10倍。

33桂枝饮片外观形态与标准汤剂中指标成分含量、转移率和出膏率的相关性

桂枝饮片目前主要是切斜片和切段2种形式。桂枝饮片的同外观形状是否直接影响到汤剂中桂皮醛含量、转移率及出膏率？从研究结果分析，转移率及出膏率与外观形状没有显著的关系，而与汤剂中桂皮醛含量相关。一般个小的桂枝饮片其汤剂中桂皮醛含量相对较高。这与药典规定的桂枝来源于嫩枝以及桂皮醛主要分布在桂枝皮部[11]结果相一致。同时，这也为感官鉴别桂枝饮片质量提供了参考。

34工艺改进

前期预实验中随机选取了GZ08样品，严格按照《中药饮片标准汤剂研究策略》给定的工艺参数，采取回流提取，不单独提取挥发油，分别制备浓缩前和浓缩后的样品，发现浓缩后桂皮醛的转移率偏低，为104%；而浓缩前转移率为462%。从中可以推断，浓缩过程显著的影响桂皮醛的含量。为解决浓缩后转移率偏低问题，经查文献[1214]，发现以桂皮醛为指标成分含量测定时，桂枝的提取大多是用挥发油提取器提取或水蒸气蒸馏的方法。因考虑到水蒸气蒸馏同时会带有大量的水，后期可能还是面临浓缩过程。因此，选择了挥发油提取器提取的方法。桂枝挥发油是重油，因此采用重油挥发提取器按照标准汤剂工艺参数提取。将所得的汤剂浓缩至适量，兑入提取出的挥发油。通过提取挥发油后兑入的方法，桂皮醛的转移率与浓缩前相当。有文献报道[15]桂枝配方颗粒的研究也需要单独提取出挥发油，将提取出的挥发油经过β环糊精包合后，然后浓缩、干燥、制粒。因此，对于检测指标为挥发性成分且含有挥发油的，应针对品种特性，重视挥发油的提取。对于一煎提取时间的确定，依据文献[16]确定为2 h，加8倍水量，每100 g饮片可提出069 mL挥发油。对于二煎提取时间的确定，考察了20，30，60 min挥发油的体积，结果30 min较为合适。因此，确定一煎为2 h，二煎为30 min。

35出膏率问题

出膏率是指固体物得率，一般方法为取适量溶液，105 ℃烘3 h，置干燥器冷却30 min，称定质量。而对于桂枝饮片，为快速简便，仍可以采用这种方法。因为桂枝饮片提取的挥发油量少，对出膏率的结果几乎没有影响。但是，对于含挥发油量多的饮片，必须把溶液和挥发油分开，建议做法为取适量溶液（未兑入挥发油），105 ℃烘3 h，置干燥器冷却30 min，加入挥发油，称定质量。这样就可以避免干燥过程中挥发油损失而造成出膏率结果不恰当的问题。

36桂枝饮片标准汤剂的应用

为满足现代人生活方便、快捷的需求，中药饮片出现了多种创新形式，如超微颗粒、破壁饮片、配方颗粒。这些新型饮片形态上失去了传统饮片的鉴别特征，内在质量又缺失统一的评价标准，不利于市场监管和流通。中药饮片标准汤剂正是为了解决上述问题应运而生，它从定量和定性2个方面共同把控包括配方颗粒在内的新型用药形式质量。定量指标包括转移率范围、出膏率范围、pH范围，它能为内在质量评价提供合理的参照数值；定性指标为饮片标准汤剂特征图谱，它能从谱图信息上弥补对传统饮片的鉴别。因此，定量和定性指标之间是相辅相成，共同构成了一个完整的质量标准评价体系。本文对桂枝饮片标准汤剂也着重从定量和定性两方面加以研究，建立了一套完整的桂枝饮片标准汤剂质量评价体系。因此，它对桂枝配方颗粒在内的新型饮片形式具有标准参照的作用。

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[责任编辑孔晶晶]