刺老苞根皮含药血清对原代成骨细胞Wnt/βcatenin信号通路的影响

依香叫　李金诚　王松月　燕梦云　崔箭　裴凌鹏

[摘要]该文研究了不同浓度刺老苞根皮含药血清对原代成骨细胞Wnt/βcatenin信号通路中βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF和Axin表达的影响。经SPF级健康雌性SD大鼠（80只）给予蒸馏水、刺老苞根皮水煎剂高、中、低3种剂量，连续灌胃7 d，制备刺老苞根皮含药血清。体外培养原代成骨细胞（OB）并鉴定，取第3代成骨细胞，培养48 h后用各组含药血清干预培养10 d，采用茜素红染色钙化结节并计数；干预培养48 h后收集细胞，分别采用Realtime PCR（RTPCR）和Western blot 法测定βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF和Axin的表達情况。结果显示，经鉴定体外培养细胞为原代成骨细胞；在干预培养后，与模型组相比，各剂量组可促进原代成骨细胞的矿化能力，且上调βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF mRNA和蛋白的表达，下调Axin mRNA和蛋白的表达。结果发现刺老苞根皮含药血清可通过调节原代成骨细胞Wnt/βcatenin信号通路中βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF和Axin表达，增强成骨细胞的分化和增殖。

[关键词]刺老苞根皮； 原代成骨细胞； Wnt/βcatenin； 信号通路

[Abstract]This paper was aimed to investigate the effect of Aralia echinocaulis containing serum on expression of βcatenin， Wnt1， Frizzed2， TCF and Axin in Wnt/βcatenin signaling pathway of primary osteoblasts SD healthy female rats （n=80） were used to make A echinocaulis containing serum by gastric perfusion for seven days with distilled water， A echinocaulis decoction high dosage， middle dosage， and low dosage In vitro， primary osteoblasts were cultured and identified The third generation primary osteoblasts were taken and cultured for 48 h， then cells were treated with the different drug serums for 10 days and calcified nodules were counted by alizarin red staining The cells were collected after treatment for 48 h and the expression levels of βcatenin， Wnt1， Frizzled2， TCF and Axin were detected by Realtime PCR and Western blot The results suggested that the in vitro cells were primary osteoblasts； and after treatment， various doses groups could promote the mineralization ability of primary osteoblasts， upregulate the mRNA and protein expression levels of βcatenin， Wnt1， Frizzled2， and TCF， and downregulate the mRNA and protein expression levels of Axin These findings indicated that A echinocaulis containing serum can enhance the differentiation and proliferation of osteoblasts by regulating the expression levels of βcatenin， Wnt1， Frizzled2， TCF and Axin in Wnt/βcatenin signaling pathway of primary osteoblasts

[Key words]Aralia echinocaulis； primary osteoblasts； Wnt/βcatenin； signaling pathway

近年来，民族药物资源的开发和利用倍受国内外研究学者的关注和青睐，传统土家族医药——刺老苞根皮为五加科植物楤木Aralia chinensis L或棘茎楤木A echinocaulis HandMazz 的根皮或茎皮，分布于我国西南、华南及华东山区，包括云南东南部及西双版纳地区、贵州黔南州及黔东南州、广西壮族自治区、海南省五指山周围地区、广东省山区、福建省中南部地区、江西省南端、台湾省等地山区，资源非常丰富[12]。该药材片状或槽状，气微香，嚼之带黏液性，味辛，性平。归肝、肾经，功能滋阴健肾，祛风湿，壮筋骨，散瘀血，消肿毒。可用于风湿痹痛、跌打损伤、骨折等治疗[34]。骨折愈合是一个复杂的全身性协调活动过程。在骨折愈合过程中，主要由负责骨吸收的破骨细胞和负责骨形成的成骨细胞共同完成，骨折后，成骨细胞对此信号做出应答，募集破骨细胞到骨折部位，促进骨质吸收，紧接着成骨细胞进行重新成骨，在神经调节和生物力学作用下使损伤骨组织恢复正常。在整个骨折愈合过程中，成骨细胞扮演者重要的角色，经研究表明，在经典Wnt信号转导通路作用下可引导成骨细胞分化，促进骨折愈合。目前实验证明刺老苞根皮具有促进大鼠骨折愈合的作用，但其分子机制层面研究甚少，为了进一步明确刺老苞根皮含药血清对成骨细胞分化、增殖和功能的影响，本实验通过观察刺老苞根皮含药血清对原代成骨细胞Wnt/βcatenin信号通路中相关基因和蛋白βcatenin，Wnt1，Frizzled2，TCF，Axin表达的作用，探讨刺老苞根皮修复大鼠骨折的分子作用机制。

1材料

11动物新生24 h SD大鼠乳鼠10只。SPF级健康雌性SD大鼠80只，3月龄，体重（270±20） g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号SCXK（军）20120004。

12药物刺老苞根皮，采于湖北恩施地区，经北京中医药大学生药系杨瑶珺教授鉴定，批号0P1101，湖北恩施中药材有限公司。

13试剂αMEM培养基，胎牛血清，025%胰蛋白酶溶液（Gibco，美国），青霉素/链霉素，DMSO，II型胶原酶，β甘油磷酸钠，抗坏血酸，茜素红，二甲基亚砜（Sigma，美国），PBS 磷酸盐缓冲液（粉剂）（北京昌盛生物技术有限责任公司），碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建成生物制品有限公司），BCA 蛋白定量试剂盒（北京赛诺博生物科技有限公司），ECL（Millipore，美国），山羊抗兔IgG（H+L），HRP，山羊抗小鼠IgG（H+L），HRP，牛抗山羊IgG（H+L），HRP（北京天德悦生物科技有限责任公司），GAPDH 鼠单抗（Immunoway，美国），βcatenin，Wnt1，TCF（Cell Signaling Technology，美国），Axin，Frizzled2（Santa Cruz，美国），TRNzol Universal 总RNA 提取试剂，FastQuant RT Kit（With gDNase）（天根生化科技有限公司）。

14仪器细胞超净操作台（苏州苏洁净化设备有限公司），CO2培养箱，Fresco低温冷冻离心机，MultiSkan3酶标仪（Thermo Scientific，美国），电脑型倒置显微镜（OLYMPUS，日本），Mini P4电泳槽，湿转电泳槽（北京凯元信瑞仪器有限公司），电泳仪，半干槽（BioRad，美国），水平脱色摇床（江苏其林贝尔仪器有限公司），酸度计pH211（Hanna，意大利），电动组织匀浆器（Fluka，美国），ABI 7900HT荧光定量PCR仪（KAPA Biosystems，美国）。

2方法

21刺老苞根皮含药血清制备与分组含药血清制备：SPF级健康雌性SD大鼠80只适应性喂养1周后，通过在胫骨上打孔模拟骨折二期愈合的理想力学环境：早期模拟坚强固定下的力学环境，后期随骨传导支架形成，开始承受应力刺激，模拟二期愈合力学环境。术后第2天用SPSS软件随机数字的方法分成4组，分别为模型组、刺老苞根皮低剂量组、刺老苞根皮中剂量组、刺老苞根皮高剂量组，每组20只。用药剂量根据人体习用安全剂量（70 kg体重20 g生药），按人/鼠表面积比率换算等效计量法计算。刺老苞根皮灌胃剂量为18 g·kg-1·d-1，以临床剂量为中剂量，1/2，2倍剂量为低、高剂量（即分别为09，36 g·kg-1·d-1）。模型组给予等剂量等频率蒸馏水。术后7 d取材（取材前进食12 h），末次给药后1 h，称重，3%戊巴比妥钠（3 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，在无菌操作下腹主动脉采血，将采集来的血样在室温下静置2 h后，1 800 r·min-1離心20 min，分离出血清，56 ℃水浴灭活30 min，在022 μm微孔膜过滤除菌后分装，保存于-20 ℃备用。

实验共分为4组：模型组（20%模型组大鼠血清+αMEM）、低剂量组（20%刺老苞低剂量含药血清+αMEM）、中剂量组（20%刺老苞中剂量含药血清+αMEM）、高剂量组（20%刺老苞高剂量含药血清+αMEM）。

22原代成骨细胞培养及鉴定取新生24 h内的SD乳鼠10只，放入75%乙醇浸洗乳鼠，将乳鼠转移到一个有盖培养皿内，在无菌操作下，分离颅骨，清除颅骨表面的结缔组织，用PBS简单冲洗颅盖骨后放入15 mL离心管内，加入3 mL 025%胰蛋白酶液Ⅱ型胶原酶溶液（1∶2），37 ℃恒温水浴振荡消化5 min，弃上清液。加入3 mL消化液，37 ℃恒温水浴振荡消化10 min，收集上清液，并重复消化4次，将收集的消化液1 500 r·min-1离心4 min，弃上清液，重悬细胞，调整细胞密度后接种于25 cm2培养瓶，培养24 h后，换成骨细胞分化培养基（10% FBS+10 mmol·L-1β甘油磷酸钠+50 mg·L-1抗坏血酸），每3 d换液1次，待细胞融合50%～70%后，消化并传代，取3～6代细胞进行试验。取第3代纯化的原代成骨细胞，经ALP染色和茜素红染色鉴定获得的是成骨细胞。

23茜素红染色法检测骨矿化功能收集第3代原代成骨细胞，以1×105 个/mL，接种于24孔板，每孔1 mL，培养48 h后按实验分组更换不同培养基，每组设3个复孔，每2 d换液1次，并每天观察细胞状态，10 d后，取出24孔板，用PBS冲洗3遍，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛固定15 min，蒸馏水冲洗3遍，每孔加入2 mL茜素红染液，放置于37 ℃，45 min后蒸馏水冲洗3遍，用荧光倒置显微镜拍照，并计数钙化结节数量。

24Westernblot检测βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF和Axin的蛋白表达量收集第3代原代成骨细胞，以1×105个/mL，接种于6孔板，每孔2 mL，培养48 h后按实验分组更换不同培养基，每组设3个复孔，培养48 h后收集细胞，用预冷RIPA蛋白抽提试剂提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量，调整蛋白浓度后煮沸变性进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，将膜完全浸没于3%BSATBST中室温轻摇30 min，室温下一抗孵育10 min，4 ℃过夜，TBST洗膜，二抗孵育40 min，TBST洗膜，ECL加到膜上后反应3～5 min，胶片曝光，显影，定影，对印迹目的条带进行扫描，TotalLab Quant软件分析图片中的条带灰度值。实验重复4次。

25荧光定量PCR检测βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF和Axin mRNA的表达量收集第3代原代成骨细胞，以1×105 个/mL，接种于6孔板，每孔2 mL，培养48 h后按实验分组更换不同培养基，每组设3个复孔，培养48 h后收集细胞，用Trizol Universal 试剂提取总RNA，使用FastQuant RT Kit（With gDNase）将RNA逆转录合成cDNA。使用PrimerBlast设计引物，退火温度55～60 ℃，PCR扩增反应体系：95 ℃预变性30 s进入循环，95 ℃变性15 s，56 ℃复性20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。扩增之后，做溶解曲线检测产物的均一性。每个反应均重复3次。引物序列见表1。经检测，每对引物的扩增效率均接近于1。使用2-ΔΔCt方法计算样本目标基因相对含量，GAPDH为内参基因。

经琼脂糖凝胶电泳，分析数据。

26统计学分析实验数据使用SPSS 200软件进行数据分析处理。以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<005为有统计学意义，P<001有显著统计学意义。

3结果

31原代成骨细胞的鉴定原代成骨细胞用成骨细胞完全培养基（含10%胎牛血清）在37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养。经倒置显微镜观察，细胞在24 h后开始贴壁，48 h后完全贴壁，细胞为单核，呈长梭形和多角形等形态，10 d左右细胞融合成铺路石样，并伴有矿化结节的出现，见图1。

32茜素红染色法检测骨矿化功能不同浓度含药血清对成骨细胞作用10 d后，经茜素红染色后，计数钙化结节的个数，结果显示：与对照组相比较，不同浓度含药血清组干预后的成骨细胞产生的钙化结节皆有所增多，低剂量组差异明显（P<005），中剂量组和高剂量组差异显著（P<001），见表2。

33Western blot检测βcatenin，Wnt1，Frizzled2，TCF和Axin的蛋白表达量经Western blot检测不同浓度含药血清对原代成骨细胞分化过程中不同细胞因子相对蛋白表达量的影响，结果显示：与对照组相比较，不同浓度含药血清组可以有效地上调βcatenin，TCF，Wnt1，Frizzled2蛋白表达，下调Axin蛋白表达。其中与对照组相比，低剂量组的βcatenin，TCF和Frizzled2蛋白表达明显上调（P<005），中剂量组βcatenin蛋白表达显著上调（P<001），TCF和Frizzled2蛋白表达明显上调（P<005），高剂量组βcatenin，TCF和Frizzled2蛋白表达显著上调（P<001）；各剂量组Wnt1蛋白的表达量较对照组显著上调（P<001）。与对照组相比，低剂量组Axin蛋白表达下调（P<005），且中剂量组与高剂量组较对照组显著下调（P<001），见表3。

34荧光定量PCR 检测βcatenin，Wnt1，Frizzled2，TCF，Axin mRNA的表达量经荧光实时定量PCR（Realtime PCR）检测含药血清对原代成骨细胞特定表达基因的相对表达量。结果显示：与对照组相比较，不同浓度含药血清组可以有效地上调βcatenin，TCF，Wnt1，Frizzled2 mRNA表达，下调Axin mRNA表达。其中与对照组相比，低剂量组的βcatenin，TCF，Wnt1和Frizzled2 mRNA表达较对照组明显上调（P<005），中剂量组中βcatenin，Wnt1 mRNA表达量显著上调（P<001），TCF，Frizzled2 mRNA表达明显上调（P<005）；高剂量组中βcatenin，TCF，Wnt1，Frizzled2 mRNA表达显著上调（P<001）。与对照组相比，低剂量组和中剂量组中 Axin mRNA表达下调（P<005），高剂量组Axin mRNA表达显著下调（P<001），见表4。

4讨论

Wnt/βcatenin信号通路被称为Wnt的经典通路，是4条Wnt信号通路之一[3]。Wnt经典通路，通过βcatenin激活基因转录，是骨重建调控的重要途径。在骨重建过程中成骨细胞起着关键性的作用，因此探讨成骨细胞的成骨分化对研究骨折愈合有着重要的意义。大量研究证明，在Wnt的经典通路中βcatenin是核心调控因子，它决定着骨软骨祖细胞在模内和软骨内向软骨细胞还是成骨细胞分化的重要因素，当Wnt与卷曲蛋白（Frizzled2）受体结合后，通过破坏由Axin，APC，GSK3，βcatenin等结合形成的“破坏复合体”，使细胞质内的βcatenin稳定，并很快进入细胞核内与转录因子TCF/LEF结合，促进TCF/LEF与特定靶基因的启动子结合，激活靶基因转录，使骨髓间充质干细胞向骨软骨细胞前体分化，从而促使成骨细胞的成骨分化，最终促进骨形成，使骨折愈合[7]。由此可见βcatenin，TCF，Wnt1，Frizzled2在Wnt/βcatenin信号通路起正调节作用，Axin具有负向调节作用。土家族在长期医疗实践中，形成了土家族传统医学理论体系，其中的“三元”学说认为，骨折后必须经脉畅通，气、血、精充分滋养，三元（头元、腹元、足元）调和，冷热平衡，才能愈合。刺老苞根皮是土家族习用草药，有着滋阴补肾，祛风湿，壮筋骨，散淤血，消肿毒等功效。在治疗骨折时，惯用内服刺老苞根皮水煎剂，并有很好的疗效[56，89]。以往研究表明，刺老苞根皮黄酮化合物可有效抗维甲酸引起的大鼠骨生长抑制及骨丢失，并对绝经后所致骨质疏松引起的骨折有一定防治作用[10]。刺老苞根皮水提物有增强碱性磷酸酶活性，促进骨形成，提高骨矿物质水平与骨密度值的作用[11]。在临床上，通过刺老苞膠囊治疗60例膝关节骨性关节炎患者的临床疗效发现刺老苞胶囊既能减轻膝关节骨性关节炎患者局部症状、体征，恢复关节功能，并能改善患者其他并发症，且服用安全[12]。现实验结果表明：经刺老苞根皮含药血清干预后，Axin表达下调，βcatenin，TCF，Wnt1和Frizzled2表达上调，说明由Axin，APC，GSK3，βcatenin等结合形成的“破坏复合体”被破坏，胞质内βcatenin积累并转移至细胞核内，与TCF/LEF启动靶基因，从而促进成骨细胞的分化与增殖。由于βcatenin是Runx2和Osterix的上游信号因子，目前研究证明Runx2和Osterix缺失的小鼠，完全缺乏成骨细胞，产生的软骨骨架完全缺乏矿化基质[1315]。因此，实验选取βcatenin，Wnt1，TCF，Axin 和 Frizzled2细胞因子探讨刺老苞根皮对骨折愈合作用的分子机制，为进一步研究提供新思路，为临床用药提供新依据。尽管如此，有关刺老苞根皮促进骨折愈合的作用机制还存在很多不清楚的地方，尚需进一步探讨。

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[責任编辑张宁宁]