QuEChERS—液质联用法测定水果蔬菜中氯吡脲残留

胡江涛 俞凌云 帅培强 于刚 何开蓉

摘要[目的]采用快速提取-高效液相色谱-串联质谱法（QuEChERS-HPLC-MS/MS）建立水果蔬菜中氯吡脲残留的检测方法。[方法]样品经含0.1%乙酸的乙腈溶液提取，经QuEChERS法净化后采用HPLC-MS/MS法测定其氯吡脲残留量。[结果]该方法下氯吡脲在水果蔬菜中的检出限（LOD）为1.0 μg/kg，定量限（LOQ）为5.0 μg/kg。在2.0～1000 μg/L范围内线性关系良好（R2>0.999）。在100～5000 μg/kg的添加水平上，方法的平均回收率介于72.0%～115.0%，方法的相对标准偏差为1.5%～9.8%。[结论]该方法适用于水果蔬菜中氯吡脲的测定。

关键词检测；氯吡脲；水果蔬菜；高效液相色谱-串联质谱法

中图分类号TS207.5+3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）17-0071-05

Abstract[Objective] A quick extraction method QuEChERSHPLCMS/MS was established to determine forechlorfenuron in fruits and vegetables. [Method] Fruits and vegetables were extracted with 0.1% acetic acid of acetonitrile solution and purified by QuEChERS， then forechlorfenuron residues were determined by HPLCMS/MS. [Result] The limits of detection （LODs） and low determination limit （LOQ） for the forechlorfenuron was 1.0 μg/kg and 5.0 μg/kg in fruits and vegetables， respectively. Regression equations of these hormones had a good linear relationship （R2>0.999） within 2.0-100.0 μg/L. The average recoveries of forechlorfenuron was in the range of 72.0%-115.0% with the coefficients of variation between 1.5% and 9.8% at the spiked levels of 10.0-500.0 μg/kg. [Conclusion] The method can be applied for the determination of the forechlorfenuron in fruits and vegetables.

Key wordsDetermination；Forechlorfenuron；Fruits and vegetables；HPLCMS/MS

基金項目四川省科技支撑计划项目（2015GZ0084，SK0604）；四川省卫生厅项目（2012-001）。

作者简介胡江涛（1974—），男，四川遂宁人，高级工程师，硕士，从事食品理化检验研究。

收稿日期2017-03-29

氯吡脲（Forechlorfenuron）是一种高效植物生长调节剂，商品名吡效隆，又称为调吡脲、吡效隆醇、施特优。现代农业生产大多受益于植物生长调节剂（植物生長激素），但这些激素的应用虽然可以改善水果外观、提高其产量，但其内在质量明显下降[1]，更重要的是摄入过量激素可能对人体带来潜在健康危害。

欧盟、日本等国家对氯吡脲的残留量作出了限定。欧盟要求其成员国常规监测环境中的氯吡脲，防止其对环境可能产生的危害。日本“肯定列表”对果蔬中氯吡脲的限定，规定在香瓜、葡萄、梨、猕猴桃等水果蔬菜中的残留限量值暂定为0.1 mg/kg；以色列规定梨、猕猴桃、葡萄中氯吡脲的残留限量为0.01 mg/kg；韩国规定瓜类中氯吡脲的残留限量值为005 mg/kg。我国在2009年农业部NY 1500.75.1—2009中规定了西瓜、黄瓜、猕猴桃和葡萄中氯吡脲的残留限量分别为0.1、0.1、0.05和0.05 mg/kg。查阅我国有关植物生长调节剂的规定发现，目前还没有相关的检测国家标准，相关产品说明多借鉴国外标准。

随着仪器分析的不断发展，液质联用分析法在农兽残留分析检测中占据了重要的地位，特别是三重四极杆质谱的出现，相比传统的高效液相色谱法，液相色谱-三重四极杆串联质谱在农药残留的检测中具有一定的优势[2-3]。多年来，液相色谱法[4-7]广泛地用于各种药物的检测，但方法的前处理较复杂，检测器的灵敏度也不能达到目前各国限量要求，且每个样品通常需要过一次甚至几次固相萃取小柱，不能适应于大量样品的快速检测。

该研究建立了一种QuEChERS提取，高效液相色谱-串联质谱法测定水果蔬菜中氯吡脲的方法。该方法操作简单、经济、快速，同时净化效果好，回收率稳定，易于掌握。

1材料与方法

1.1材料

供试蔬菜水果样品：葡萄、猕猴桃、水蜜桃、黄瓜、草莓、枇杷、西瓜、西红柿、西芹、苦瓜、茄子、苹果、樱桃，市售。

氯吡脲标准品，纯度≥96%，美国Sigma公司；乙腈，色谱纯，德国CNW技术有限公司；正己烷、冰乙酸、无水乙酸钠、氯化钠、无水硫酸钠和无水硫酸镁，分析纯，成都科龙化工有限公司；氯化钠：450 ℃灼烧4 h，密封备用；无水硫酸钠和无水硫酸镁：650 ℃灼烧4 h，贮藏干燥器中备用；

N-丙基乙二胺（PSA，粒度40 μm）、十八烷基硅烷键合相（C18，粒度50 μm），购于北京迪马欧泰科技发展中心。

主要仪器设备：

超高效液相色谱（Waters ACQUITY UPLC）-三重四极杆串联质谱（Aglient 6510）联用仪，配有电喷雾离子源（ESI）；涡旋混合器，上海精宏；超声波清洗器；J2-21离心机、样品粉碎机、组织捣碎机，美国贝克曼库尔特；高速组织匀浆机，日本TAITEC。

1.2标准溶液配制

1.0 mg/mL氯吡脲标准储备溶液：准确称取氯吡脲标准品10 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，置-18 ℃冰箱中保存。根据需要用乙腈将标准储备液稀释成适当浓度的标准工作液，临用现配。

1.3仪器条件

1.3.1色谱条件。

色谱柱：MG-II C18柱（2.1 mm×150.0 mm ×5.0 μm）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：0.2 mL/min；流动相：A（乙腈），B（0.1%乙酸水溶液）。等度洗脱条件为乙腈∶0.1%乙酸水溶液（V/V）=6∶4。

1.3.2质谱条件。

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；定量离子对308.9/288.9（m/z）；定性离子对为308.9/288.9（m/z）和308.9/92.9（m/z）。

1.4样品处理

样品进行粉碎提取，获得提取液。

称取005 g N-丙基乙二胺（PSA），0.1 g C18，0.15 g无水硫酸镁置于10 mL具塞玻璃离心管中，准确加入2.0 mL样品提取液至离心管中，涡旋振荡1 min，以5 000 r/min的转速离心2 min。取上清液1 mL过0.22 μm有机微孔滤膜，供液相色谱-质谱测定。

2结果与分析

2.1净化方法的优化

2.1.1提取液的选择。

乙腈是一种良好的提取剂，在现代的农兽残留检测中常用来作为提取剂。乙腈可以与水任意比混溶，可与样品组织细胞中待测物有效接触，当加入盐后又能迅速与水分层，且乙腈本身对样品中的糖、脂肪和蛋白质的溶解性较小，对蛋白有沉淀作用。该研究考察了含有01%乙酸的乙腈和乙腈作为提取剂的提取效率，发现两者并没有多大差别。氯吡脲在弱酸性至中性条件下是非常稳定的，在碱性环境下易分解，为保持氯吡脲在样品前处理中的稳定，方法在提取液乙腈中加了0.1%乙酸，以保护待测物在提取过程中和检测过程中的稳定态。

2.1.2提取方式及温度的选择。

该试验比较了超声提取和机械振荡提取，发现超声提取的回收率要稍微高一些。原因是超声提取中超声波可以破坏细胞壁，使乙腈能更好地渗透进入细胞内部进行萃取，而机械振荡无法破坏细胞壁。因此该方法选择用超声提取的方式。

超声提取的水浴温度对回收率也有影响，如果温度过低，不利于溶剂渗透到样品内部提取，特别是畜禽产品，油脂在低温下要凝固，不利于提取。因此要保持适当的提取温度，该方法选择超声提取温度为30 ℃。

2.1.3净化方法选择。

QuEChERS是近年来国际上兴起的快速高效多残留检测前处理技术。2003年，美国农业部专家Steven博士提出了QuEChERS（ quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）快速多农残检测方法，它是一种快速、简便、价格低廉、适用面广的样品前处理方法。在该方法出现后的几年间，欧盟每年已有超过100个实验室参加此方法的验证试验，证明这种方法在实验室间取得成功。目前，该方法已被很多国家列为农药残留分析标准分析方法，如AOAC Official method 2007（01）、英国标准方法BS EN 155662：2008等[8-10]。研究过程中在总结多年的应用基础上对该方法进行了一些改进，加入了C18固相吸附剂，对试样中的蛋白质、脂肪酸、色素有一定的吸附。

C18固相吸附剂是一种非极性吸附剂，可以吸附高分子量的非极性干扰物质，特别适用于低脂类水果蔬菜的净化，对样品中的蛋白、脂质物质、部分维生素、色素和甾醇等杂质也有一定的吸附作用。

PSA是一类性质与氨基柱固相萃取小柱填料相同的固相吸附剂，不同的是PSA有2个氨基，它们的主要作用力是极性和阴离子交换作用。它常用来消除各种有机酸、部分色素以及蛋白质、糖类和脂肪酸。

石墨化碳黑（GCB）主要是用来去除类甾体、叶绿素等色素。该研究考察了NH2类填料和GCB的实际效果，发现NH2可去除90%以上的脂肪酸和50%左右的色素；GCB可去除90%以上的色素，但对脂肪酸的净化能力仅有10%左右。笔者考察GCB对氯吡脲的吸附情况时，发现GCB对氯吡脲有较强的吸附作用，故在该试验中放弃了加入GCB来进行净化的手段。

2.1.4吸附剂用量的影响。

该试验考查了C18和PSA吸附剂对氯吡脲的吸留作用。吸取浓度为100 μg/L的氯吡脲标准液分别用2种固相吸附剂净化。测定结果见表1。

由上述试验可以得出如下结论，C18吸附剂对氯吡脲基本无吸附，用量200 mg时回收率仍在80%以上，而PSA对氯吡脲吸附有影响，PSA增大到100 mg以上回收率下降得較快。无水硫酸钠和无水硫酸镁对待测物基本无吸附。因此该试验方法选择用2 mL提取液，加入50 mg PSA、100 mg C18和200 mg无水硫酸镁。

2.1.5涡旋振荡时间的影响。

C18吸附剂和PSA吸附剂与样液接触时间也有影响。该试验考察了对加标样品涡旋振荡1、2、3、4和5 min时，吸附剂对氯吡脲的吸留作用。测定结果表明，回收率的变化不大，在10%内波动。因此涡旋振荡时间对氯吡脲影响不大，但为了规范统一操作，规定提取液中加入吸附剂后，每份试样净化时涡旋的时间准确定为1 min。处理好的試样液应尽快离心，过滤膜上机测定。

2.2儀器條件的优化

2.2.1色谱条件的优化。

在液相色谱-串联质谱测定时，在流动相中加入低浓度的甲酸或乙酸胺溶液，有利于目标化合物离子化，可以提高灵敏度和分离度，使色谱峰形对称、尖锐。通过试验验证选择乙腈+0.1%乙酸水溶液作为流动相。等度洗脱条件为乙腈∶0.1%乙酸水溶液（V/V）=6∶4。氯吡脲标准（10 μg/L）的总离子流图及MRM图如图1所示。

2.2.1质谱条件的优化。

采用注射泵直接进样方式，以10 μL/min流速将氯吡脲标准溶液注入离子源中，在正离子检测方式下对目标化合物进行一级质谱分析（Q1扫描），得到分子离子峰，对该分子离子峰进行二级质谱分析（子离子扫描），得到碎片离子信息，获得该物质的二级质谱图，见图2和图3。然后对去簇电压（DP）、碰撞气能量（CE）进行优化，使分子离子和特征碎片离子对强度达到最佳。并优化雾化气、气帘气、辅助加热器、离子源温度、电喷雾电压，使目标化合物的离子化效率达到最佳。得到的质谱条件如下：

离子源为电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描方式多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）5 200 V，离子源温度（TEM）450 ℃；碰撞气压力（CAD）20.68 kPa；雾化气压力（GS1）68.95 kPa；气帘气压力（CUR）62.05 kPa；其他质谱参数见表2。

2.3分析方法的评价

2.3.1线性范围和测定低限。

根据氯吡脲的灵敏度，分别配成2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L一系列标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，进样量10 μL，峰保留时间和子离子峰度比定性，用峰面积对其定量，其线性范围2.0～100.0 μg/L、线性方程Y=1 210X+893（其中X为氯吡脲顶量浓度，Y为峰面积），线性相关系数为0.999 9，方法的检出限（LOD）为1.0 μg/kg，定量限（LOQ）为5.0 μg/kg。

2.3.2方法的回收率和精密度。

分别按试样中氯吡脲限量水平进行加标5.0～50 μg/kg含量水平标准液，每一添加浓度重复10份样品，按上述试验方法测定，得到添加浓度范围的回收率见表3。测定回收率和室内精密度，方法的总体平均回收率72.0%～115.0%，方法的相对标准偏差为1.5%～9.8%。

3结论

该试验建立了高效快速提取-高效液相色谱-串联质谱法（QuEChERS-HPLC-MS/MS）测定水果蔬菜中氯吡脲残留的检测方法。试验选择有代表性的13种水果蔬菜进行了方法研究，方法的测定低限（LOD）为1.0 μg/kg，方法的总体平均回收率为72.0%～115.0%，方法的相对标准偏差为1.5%～9.8%。该方法操作简单、经济、快速，同时净化效果好，回收率稳定，适用于水果蔬菜中氯吡脲的测定。

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