高效液相色谱法测定醋制消肿止痛液中苦参碱、氧化苦参碱、羟基红花黄色素A的含量Δ

彭宏伟，郭丽华

(1.曲阜师范大学医院药剂科，山东 曲阜 273165； 2.曲阜师范大学化学与化工学院，山东 曲阜 273165)

高效液相色谱法测定醋制消肿止痛液中苦参碱、氧化苦参碱、羟基红花黄色素A的含量Δ

彭宏伟1*，郭丽华2

(1.曲阜师范大学医院药剂科，山东 曲阜 273165； 2.曲阜师范大学化学与化工学院，山东 曲阜 273165)

目的：建立醋制消肿止痛液中苦参碱、氧化苦参碱、羟基红花黄色素A的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为Sinochrom ODS-BP色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速为1.0 ml/min；柱温为30 ℃。测定苦参碱、氧化苦参碱采用流动相乙腈-0.2%磷酸水(V∶V=92∶8)，用三乙胺调pH至6.0，检测波长为220 nm；测定羟基红花黄色素A采用流动相乙腈-0.2%甲酸水(V∶V=15∶85)，检测波长为403 nm。结果：苦参碱、氧化苦参碱、羟基红花黄色素A的进样量分别在0.412～1.648、0.448～1.792、0.220～0.880 μg范围内与峰面积具有良好的线性关系(r分别为0.999 5、0.999 3、0.999 4)；苦参碱的平均加样回收率为98.90%，RSD为0.42%；氧化苦参碱的平均加样回收率为99.08%，RSD为0.69%；羟基红花黄色素A的平均加样回收率为99.03%，RSD为0.44%。结论：本方法操作简便、结果准确、重现性良好，可作为该制剂的质量检测标准，并为其开发应用提供了理论基础。

高效液相色谱法； 醋制消肿止痛液； 苦参碱； 氧化苦参碱； 羟基红花黄色素A； 含量

醋制消肿止痛液主要由苦参、红花、车前草、蒲公英、川椒等7味中药组成，具有散寒止痛、祛风除湿、温通筋络、活血化瘀的功效，可用于证属淤滞型或风寒湿型的各种急、慢性闭合性软组织损伤，关节扭伤，腰肌劳损及肩周炎等的治疗。苦参为方中君药，有清热利湿、祛风杀虫、解毒等功效[1]。现代研究结果表明，苦参的化学成分主要为生物碱和黄酮类[2-3]，具有抗菌、抗炎、镇痛、抗变态反应、抗肿瘤等多种药理活性[4-7]。红花为方中臣药，具有活血通经的功效，羟基红花黄色素A为其主要活性成分[8-9]。为有效控制醋制消肿止痛液的质量，本研究建立了高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法测定该制剂中苦参碱、氧化苦参碱、羟基红花黄色素A的含量。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 infinity液相色谱仪(美国安捷伦公司)；KQ-3200DE型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；OHAUS-CP214型分析天平(奥豪斯仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

苦参碱对照品(批号：110805-200508)、氧化苦参碱对照品(批号：110780-201508)、羟基红花黄色素A对照品(批号：111637-201609)均由中国食品药品检定研究院提供；醋制消肿止痛液样品(批准文号：鲁药制字Z20130037，批号：20160510)；乙腈为色谱纯(天津市四友生物医学技术有限公司)；水为双蒸水(化学与化工学院实验室自制)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

(1)苦参碱与氧化苦参碱的测定色谱条件：色谱柱为Sinochrom ODS-BP色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.2%磷酸水(V∶V=92∶8)，用三乙胺调pH至6.0；检测波长为220 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 ml/min。理论塔板数按苦参碱与氧化苦参碱峰计应≥3 000。(2)羟基红花黄色素A的测定色谱条件：色谱柱为Sinochrom ODS-BP色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.2%甲酸水(V∶V=15∶85)；检测波长为403 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 ml/min。理论塔板数按羟基红花黄色素A峰计应≥3 000。

2.2 对照品溶液的制备

(1)精密称取苦参碱和氧化苦参碱对照品适量，加甲醇溶解制得苦参碱1.03 mg/ml和氧化苦参碱1.12 mg/ml的标准品溶液。精密吸取1 ml定容至10 ml容量瓶中，制得对照品溶液。(2)精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，加甲醇制

成羟基红花黄色素A 0.55 mg/ml的标准品溶液。精密吸取1 ml定容至10 ml容量瓶中，制得对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

(1)量取本品适量，蒸干，研细，精密称取1.0 g，置于100 ml锥形瓶中，加水50 ml，超声处理10 min，氨试液调pH至10，分别用三氯甲烷30、25、20 ml萃取，合并三氯甲烷层，滤过，滤液蒸干，加甲醇使溶解，定容至10 ml容量瓶中，混匀，再取1 ml定容至10 ml容量瓶中，混匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。(2)量取本品适量，蒸干，研细，精密称取1.0 g，置于100 ml锥形瓶中，加甲醇50 ml，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，加甲醇使溶解，定容至10 ml容量瓶中，混匀，再取1 ml定容至10 ml容量瓶中，混匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

(1)取苦参以外的其余药味，制得不含苦参的空白制剂，照“2.3”项下方法制备，即得阴性对照溶液1。(2)取红花以外的其余药味，制得不含红花的空白制剂，照“2.3”项下方法制备，即得阴性对照溶液2。

2.5 专属性试验

精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件，依法测定。结果显示，供试品溶液中苦参碱、氧化苦参碱、羟基红花黄色素A色谱峰能达到基线分离，且保留时间与对照品保持一致；阴性对照溶液在对应保留时间附近无干扰峰，溶剂峰亦无干扰，表明其余药味对苦参碱、氧化苦参碱、羟基红花黄色素A的测定无干扰，见图1。

A.苦参碱和氧化苦参碱对照品；B.苦参碱和氧化苦参碱供试品；C.阴性对照溶液1；D.羟基红花黄色素A对照品；E.羟基红花黄色素A供试品；F.阴性对照溶液2A.standard solution of matrine and oxymatrine; B.sample solution of matrine and oxymatrine; C.negative control solution one; D.standard solution of hydroxy safflower yellow A; E.sample solution of hydroxy safflower yellow A; F.negative control solution two图1 HPLC图Fig 1 HPLC chromatograms

2.6 线性关系考察

分别精密量取苦参碱和氧化苦参碱标准品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 ml，加甲醇定容至10 ml容量瓶中；分别精密量取羟基红花黄色素A标准品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 ml，加甲醇定容至10 ml容量瓶中。精密吸取上述质量浓度的标准品溶液各10 μl，按色谱条件进行测定，以进样量为横坐标(X，μg)、峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得标准曲线。结果显示，苦参碱进样量在0.412～1.648 μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=67.39X-19.84，相关系数r=0.999 5；氧化苦参碱进样量在0.448～1.792 μg范围呈良好的线性关系，回归方程为Y=66.91X-62.95，相关系数r=0.999 3；羟基红花黄色素A进样量在0.22～0.88 μg范围呈良好的线性关系，回归方程为Y=59.61X-6.21，相关系数r=0.999 4。

2.7 精密度考察

精密吸取苦参碱和氧化苦参碱、羟基红花黄色素A对照品溶液各10 μl，按上述色谱条件，重复测定6次，记录峰面积积分值。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱、羟基红花黄色素A峰面积RSD分别为0.52%、1.18%、0.79%，表明精密度良好。

2.8 重现性考察

精密称取同一批样品共6份，按“2.3”项下方法制备，依法测定，计算样品含量。结果显示，苦参碱的平均含量为4.64 mg/g，氧化苦参碱的平均含量为0.56 mg/g，羟基红花黄色素A的平均含量为1.427 mg/g，RSD分别为0.46%、0.86%、0.65%。

2.9 稳定性考察

精密吸取苦参碱和氧化苦参碱、羟基红花黄色素A供试品溶液各10 μl，分别在4、8、12、16、20、24、36 h注入液相色谱仪，依法测定峰面积积分值。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱、羟基红花黄色素A的RSD分别为0.44%、0.40%、0.39%，表明样品供试液在36 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

精密称取已知含量苦参碱(4.64 mg/g)、氧化苦参碱(0.56 mg/g)、羟基红花黄色素A(1.427 mg/g)的同一批样品6份，分别精密加入5 ml苦参碱对照品溶液(0.103 mg/ml)、氧化苦参碱对照品溶液(0.112 mg/ml)、羟基红花黄色素A(0.055 mg/ml)，按“2.3”项下制备，依法测定，结果见表1—3。

表1 苦参碱加样回收率试验结果Tab 1 Recovery test of matrine

表2 氧化苦参碱加样回收率试验结果Tab 2 Recovery test of oxymatrine

表3 羟基红花黄色素A加样回收率试验结果Tab 3 Recovery test of hydroxy safflower yellow A

3 讨论

在样品溶液制备过程中，室温(25 ℃)下直接用三氯甲烷萃取时，乳化现象非常严重，实验中尝试加少量甲醇、加热等方法破乳效果不明显。将药液放置于10 ℃下2 h，再进行萃取操作，乳化基本消失。

取苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液经TU-1 901双光束紫外可见分光光度计进行光谱扫描，结果显示，苦参碱和氧化苦参碱分别在204和206 nm处有最大吸收。但在此波长下进行测定，甲醇溶剂峰干扰较多，基线不稳定。分别有选择225[10]、208[11]、210[12]、220 nm[13]波长的文献报道，经过比较，本研究最终选择220 nm作为检测波长，此波长下干扰少，基线稳定，重复性好，且吸收度合适。

对于色谱柱的选择，文献多采用氨基柱[14]、C18柱[15]，本研究选用ODS-BP柱。经反复试验筛选，最终选择乙腈-0.2%磷酸溶液(V∶V=92∶8)用三乙胺调pH至6.0为流动相，目标峰峰形较好，拖尾有很好改善，理论板数较高。

羟基红花黄色素A含量测定方面，本研究采用乙腈-0.2%甲酸水(V∶V=15∶85)为流动相，目标峰能很好分离，但未见报道，可为羟基红花黄色素A的含量测定提供新的依据。

综上所述，本实验建立的测定方法结果准确、简便、灵敏、重现性好，可用于醋制消肿止痛液中苦参碱与氧化苦参碱、羟基红花黄色素A含量的测定，也为其进一步开发应用提供了一定的理论依据。

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Content Determination of Matrine,Oxymatrine and Hydroxy Safflower Yellow A Contents in Xiaozhongzhitong Vinegar Liquid by HPLCΔ

PENG Hongwei1,GUO Lihua2

(1.Dept.of Pharmacy，Qufu Normal University Hospital，Shandong Qufu 273165,China； 2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Qufu Normal University,Shandong Qufu 273165,China)

OBJECTIVE: To establish the method for content determination method of matrine,oxymatrine and hydroxy safflower yellow A contents in Xiaozhongzhitong vinegar liquid by HPLC. METHODS: HPLC method was adopted,the column was Sinochrom ODS-BP(250 mm×4.6 mm，5 μm),with flow rate of 1.0 ml/min and column temperature of 30 ℃. Matrine and oxymatrine were determined by mobile phase acetonitrile 0.2% and phosphoric acid water(V∶V=92∶8). Triethylamine was used to adjust PH value to 6.0,and the wave length was 220 nm. Hydroxy safflower yellow A was determined with mobile phase of acetonitrile 0.2% methanoic acid water(V∶V=15∶85) and detection wavelength of 403 nm. RESULTS: The calibration curves were linear when the sample ranges of matrine,oxymatrine and hydroxy safflower yellow A were at 0.412-1.648 μg,0.448-1.792 μg and 0.22-0.88 μg,respectively(r=0.999 5,r=0.999 3 andr=0.999 4). The average recovery rate andRSDof matrine was at 98.90% and 0.42%,oxymatrine was at 99.08% and 0.69%,and hydroxy safflower yellow A was at 99.03% and 0.44%. CONCLUSIONS: This method is simple,rapid,accurate and suitable for the detection of quality of Xiaozhongzhitong liquid,which can provide the theoretical basis for the development and application of Xiaozhongzhitong vinegar liquid.

HPLC; Xiaozhongzhitong vinegar liquid; Matrine; Oxymatrine; Hydroxy safflower yellow A; Content

2014曲阜师范大学科技计划项目(No.xkj201416)

R927.2

A

1672-2124(2017)08-1039-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.08.012

2017-03-17)

*主管药师，硕士。研究方向：中成药质量标准研究。E-mail：phw04463833@163.com