芦笋片的质量标准研究

马 静，费小凡，李文尧，宋 毅

(四川大学华西医院临床药学部，四川 成都 610041)

芦笋片的质量标准研究

马 静*，费小凡，李文尧，宋 毅#

(四川大学华西医院临床药学部，四川 成都 610041)

目的：建立芦笋片的质量控制标准。方法：采用薄层色谱法定性鉴别芦笋片中的门冬氨酸。采用反相高效液相色谱法测定芦笋片中门冬氨酸的含量，柱前衍生试剂为2,4-二硝基氟苯，色谱柱为Chromsil ODS柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流速为1.0 ml/min，流动相A为50 mmol/l的醋酸钠溶液(pH=6.4)，流动相B为体积分数50%的乙腈溶液，进行梯度洗脱，检测波长为360 nm，柱温为35 ℃。结果：门冬氨酸的线性范围为0.154～2.044 μg，r=0.999 9，平均加样回收率为98.98%，RSD为1.23%。结论：本方法稳定可靠、简便快捷、重复性好，能准确测定芦笋片中门冬氨酸的含量，为芦笋片的质量控制提供了依据。

2,4-二硝基氟苯； 柱前衍生； 门冬氨酸； 薄层色谱法； 反相高效液相色谱法； 芦笋片

芦笋片是由芦笋(AsparagusofficinalisL.)加辅料制成的薄膜衣片，具有益气生津、清热利湿、活血散结的功效，常用于高血压病、心脏病、肾炎水肿、乳腺结节等的治疗。近年来，美国学者发现芦笋还具有防止恶性肿瘤细胞扩散的功能，故临床上将芦笋片用于膀胱癌、肺癌、皮肤癌等恶性肿瘤的辅助治疗。组织蛋白和门冬酰胺是芦笋发挥药用效能的主要成分。相关研究多采用比色法测定芦笋中的总皂苷、总氨基酸的含量[1-3]，采用紫外分光光度法[4]和荧光光度法[5]检测总黄酮成分，操作较繁琐，且结果存在误差。彭友舜[8]、安玉会[9]等采用氨基酸自动分析仪来测定氨基酸，其可全面分析各种氨基酸成分，但价格昂贵，普及率较低。此外，关于芦笋含量测定的指标性成分选择，苏亚军等[6]选择芦丁，邵旭等[7]选择门冬氨酸。而本研究以芦笋中门冬酰胺的水解产物门冬氨酸作为指标成分，采用薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)及反相高效液相色谱法(reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)对其进行定性、定量鉴别，为芦笋片的质量控制提供了依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-10AT高效液相泵、SPD-M10Avp紫外检测器、CLASSVP工作站(日本岛津公司)；Shim-pack C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(日本岛津公司)；Phenomenex C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(广州菲罗门科学仪器公司)；AS3120型超声波清洗器(AUTO SCIENCE公司)；HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技仪器有限公司)； XP205DR十万分之一电子天平(METTLER TOLEDO公司)；调温电热套(ZDHW型，北京中兴伟业仪器有限公司)；PBQⅠ型薄层自动铺板器(重庆南岸新力实验电器厂)；732型阳离子交换树脂柱(廊坊圣泉化工有限公司)；自制硅胶G薄层板(取薄层层析硅胶G适量，加入磷酸二氢钾适量，混合物按固定相1份 ∶0.4%羧甲基纤维素钠的水溶液3份混合，用自动薄层制板器制成10 cm×20 cm、厚度0.4 mm、采用0.2 mol/l磷酸二氢钾溶液制备的硅胶G薄层板，晾干后，于105 ℃下烘干1 h，置于干燥器内存放)。

1.2 药品与试剂

乙酸钠、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾和2,4-二硝基氟苯(DNFB)、α-萘酚、磷酸二氢钾、茚三酮、正丙醇、硫酸、氨水等为分析纯；N,N-二甲基甲酰胺为优级纯；乙腈(色谱纯，SWELL公司出品)；纯净水(娃哈哈集团有限公司)；门冬氨酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：140691—200401)；芦笋片为实验室自制(批号：160201、160202、160203、160301、160302、160303)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 供试品溶液的制备：取样品适量，去薄膜衣研成细粉，混匀，精密称定约5 g，置于圆底瓶中，加水100 ml，加热回流提取1 h，滤过，滤液加在732型阳离子交换树脂柱(内径1 cm，长10 cm)上，用水洗至洗脱液无糖反应(取洗脱液1 ml，加α-萘酚试液3滴，沿管壁加硫酸5滴，两液界面处无红色环产生则为无糖反应)，再用2 mol/l氨试液80 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加正丙醇2 ml使溶解，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备：取门冬氨酸对照品适量，加正丙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液的制备：取处方中除芦笋主药外的空白辅料，通过相应的制备工艺制成缺芦笋的样品，再按照“2.1.1”项下方法制备，即得。

2.1.4 薄层色谱法：根据《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)“通则0502”，吸取对照品溶液5 μl、供试品溶液10 μl，分别点于同一用0.2 mol/l磷酸二氢钾溶液制备的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=8 ∶3 ∶1)为展开剂，展开，取出并晾干，喷茚三酮试液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。结果表明，供试品溶液在与对照品溶液相同位置上显相同颜色的斑点，Rf在0.3～0.7之间，斑点的分离度良好。

2.2 薄层鉴别的方法学考察

2.2.1 展开剂的选择：吸取上述对照品溶液5 μl、供试品溶液10 μl，点于同一硅胶G薄层板上，分别以丁酮-吡啶-冰醋酸-水(V∶V∶V∶V=70 ∶15 ∶2 ∶15)[10]、正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=4 ∶1 ∶1)[11]、十二烷基硫酸钠-正丁醇-正己烷-水(V∶V∶V∶V=3 ∶14 ∶2 ∶2.2)[12]、正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=8 ∶3 ∶1)为展开剂展开，将上述薄层板取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果表明，展开剂为前三种时，斑点拖尾严重，分离度差，而展开剂为第四种时，斑点分离度好，Rf适中。故以正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=8 ∶3 ∶1)为本研究的展开剂。

2.2.2 点样量的选择：吸取上述对照品溶液、供试品溶液，各2、5、10、20 μl，点于同一用0.2 mol/l磷酸二氢钾溶液制备的硅胶G薄层板上，以“2.1.4”项下的方法展开。根据斑点的清晰度和分离度，表明本研究最佳点样量为供试品溶液10 μl、对照品溶液5 μl。

2.2.3 不同检视条件的考察：取上述对照品溶液5 μl、供试品溶液10 μl，按照“2.1.4”项下方法展开，取出，晾干，分别在不同波长的紫外灯下(254 nm、302 nm、365 nm)检视，或喷茚三酮试液加热至斑点显色后于日光下检视。结果显示，最佳检视条件为喷以茚三酮试液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。

2.2.4 专属性考察：吸取对照品溶液5 μl、供试品溶液10 μl、阴性对照溶液10 μl，按照“2.1.4”项下方法检视，见图1。结果显示，阴性对照溶液在与对照品溶液相同位置上无斑点，辅料对主药成分无干扰，本方法的专属性好。

1—6.供试品溶液；7.对照品溶液；8.阴性对照溶液1—6.test solution; 7.control solution; 8.negative control solution图1 薄层色谱图Fig 1 TLC chromatogram

2.2.5 温度、湿度的考察：配置不同浓度的硫酸水溶液置于展开缸的一侧，密闭15 min后，控制其相对湿度；并将装有薄层板的层析缸分别放置在4～10 ℃冰箱中、20 ℃室温空调房中、35 ℃恒温干燥箱中进行不同温度的考察。 取上述2种溶液，按照“2.1.1”项下进行点样，分别在下列条件展开：(1)温度10 ℃、湿度45%；(2)温度10 ℃、湿度65%；(3)温度20 ℃、湿度45%；(4)温度20 ℃、湿度65%；(5)温度20 ℃、湿度85%；(6)温度35 ℃、湿度65%；(7)温度35 ℃、湿度85%，用茚三酮试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰后检视。结果表明，在上述不同温度、湿度条件下，供试品色谱在与对照品色谱的相应位置上均有相同颜色的斑点，且分离度良好，Rf值有稍许变化，说明温度在10～35 ℃范围内，湿度在45%～85%范围内，对本品的薄层鉴别影响小，重复性和稳定性好。

2.2.6 薄层板的考察：吸取上述对照品溶液5 μl、供试品溶液10 μl，在不同的薄层板下，按照“2.1.4”项下方法展开。薄层板(1)为青岛海浪硅胶干燥剂有限公司生产的硅胶G薄层板；薄层板(2)为采用0.2 mol/l磷酸二氢钾溶液自制的硅胶G薄层板。结果表明，采用薄层板(1)时，斑点分离度差，拖尾严重；薄层板(2)的特征主斑点分离度达到要求，斑点清晰。

2.3 崩解时限考察

分别取上述6个批号的样品各6片，参照《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)通则0921崩解时限[13]中的方法，在盐酸溶液(9→1 000)中进行崩解时限考察。结果表明，6批样品均在1 h内全部崩解，符合相关规定。

2.4 含量测定

2.4.1 衍生缓冲溶液的制备：称取碳酸氢钠4.2 g，置于100 ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

2.4.2 平衡缓冲溶液的制备：称取磷酸二氢钾0.68 g，置于100 ml容量瓶中，加20 ml水溶解，再加入0.1 mol/l氢氧化钠溶液29.1 ml，用水定容至刻度，摇匀，即得。

2.4.3 衍生化溶液的制备：精密量取2，4-二硝基氟苯0.1 ml，置于10 ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

2.4.4 对照品溶液的制备：精密称取门冬氨酸对照品10.22 mg，置于10 ml容量瓶中，加水溶解并摇匀，制成浓度为1.022 mg/ml的对照品储备液；精密量取对照品储备液3 ml，置于10 ml容量瓶，加水稀释成浓度为0.307 mg/ml的未衍生化对照品溶液。精密量取未衍生化对照品溶液1 ml，置于10 ml棕色容量瓶中，按照先后顺序加入衍生缓冲溶液1 ml、衍生化溶液1 ml，摇匀后密闭，在60 ℃水浴中避光反应60 min，取出，冷至室温(25 ℃)，用平衡缓冲液定容至刻度，放置15 min，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.4.5 供试品溶液的制备：取样品适量，去薄膜衣研成细粉混匀，精密称定约3 g，置于100 ml锥形瓶中。加50 ml水超声处理30 min，重复操作2次，离心，取上清液，合并后蒸干，残渣置于10 ml容量瓶中，加水定容至刻线，摇匀，即得未衍生化供试品溶液。精密量取未衍生化供试品溶液1 ml，置于10 ml棕色容量瓶中，按照先后顺序加入衍生缓冲溶液1 ml、衍生化溶液1 ml，摇匀后密闭，在60 ℃水浴中避光反应60 min，取出，冷至室温，用平衡缓冲液定容至刻度，放置15 min，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.4.6 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为360 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 ml/min；流动相A：取乙酸钠4.1 g，加水约900 ml，用醋酸调节pH至6.4，加N,N-二甲基甲酰胺溶液10 ml，置于1 000 ml容量瓶中，用水定容至刻线，即得；流动相B：乙腈-水(V∶V=1 ∶1)，进行梯度洗脱，过程见表1。结果显示，门冬氨酸主峰与其他杂质峰无干扰，各组分均能达到基线分离，理论板数≥3 000；分离度≥1.5，符合规定，见图2。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedure

A.对照品溶液；B.供试品溶液A. control solution；B. test solution图2 高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms

2.4.7 线性关系考察：精密吸取“2.4.4”项下对照品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，以绝对进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程：Y=5×106X-73 269，r=0.999 9(n=6)。结果显示，门冬氨酸进样量在0.154～2.044 μg之间呈良好的线性关系。

2.4.8 精密度考察：精密吸取“2.4.4”项下对照品溶液，重复进样6次(进样量10 μl)，记录峰面积。结果显示，门冬氨酸峰面积的RSD=0.3%，仪器精密度良好。

2.4.9 稳定性考察：精密吸取“2.4.4”项下对照品溶液、“2.4.5”项下供试品溶液各10 μl，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10 h时进样测定，记录峰面积。结果显示，对照品溶液和供试品溶液的RSD分别为0.56%和0.43%，表明对照品溶液、供试品溶液均在10 h内稳定。

2.4.10 重复性试验：取样品6份(批号：160301)，按“2.4.5”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液及“2.4.4”项下对照品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，记录峰面积。结果显示，门冬氨酸的RSD=1.81%，表明本方法重复性良好。

2.4.11 加样回收率试验：精密称取已知含量的样品(批号：160301)6份，各1.0 g，置于6个100 ml锥形瓶中，分为三组。每组分别精密加入浓度为1.31、1.58、1.89 mg/ml的对照品溶液1.0 ml，按照“2.4.6”项下色谱条件进样测定计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)Tab 2 Recovery test of Lusun tablets(n=6)

2.4.12 样品含量测定：取6批自制样品，按“2.4.5”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.6”项下色谱条件进样测定并计算样品中门冬氨酸的含量，结果见表3。

3 讨论

氨基酸类成分大部分不含芳香环等紫外吸收基团，故无法检测到紫外和荧光吸收。在一定条件下，加入衍生试剂，氨基酸反应生成有紫外吸收的氨基酸衍生物，使其在360 nm的波长处有紫外吸收。常用的衍生化试剂有异硫氰酸苯酯(PITC)、邻苯二甲醛(OPA)、DNFB和芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)等。其中OPA与氨基酸在室温条件下迅速反应，能生成强荧光衍生产物，由于OPA本身无荧光性，不会产生干扰而影响色谱的分离。但OPA只与一级氨基酸反应，且其衍生化产物极不稳定，须在数分钟内完成进样，不便于常规检测。PITC和Fmoc-Cl的适用性较为广泛，能与一级、二级氨基酸发生作用，不会产生多级和不稳定的衍生产物，但PITC衍生过程操作复杂，同时会导致色谱柱耐用性降低；而FMOC-Cl的衍生产物常用于荧光检测分析[14]。而DNFB与氨基酸的衍生化反应简便、适用性广，能与一级、二级氨基酸反应，且反应灵敏度高，在紫外区与可见光区都能进行操作，并能生成稳定单一的衍生产物，现在广泛应用于多种氨基酸的测定。本研究采用DNFB试剂，可避免试剂对测定方法的干扰，衍生法步骤简单，衍生产物稳定、分析更精确。但衍生物对光敏感，故衍生化的操作过程需要避光，应采用棕色容量瓶进行衍生反应及保存溶液。

表3 含量测定结果Tab 3 Content determination of aspartic acid

本研究考察了不同的提取条件对芦笋片含量的影响。考察条件包括：提取溶剂为20%乙醇、40%甲醇和水；提取时间45 min、提取1次，60 min、提取1次和30 min、提取2次；提取方法为回流、超声和浸泡。结果表明，提取溶剂为水，超声30 min、提取2次时，门冬氨酸的含量最高。另外,考察了柱温为25、30、35 ℃时对研究的影响。结果表明，柱温30 ℃时的分离度较好，出峰时间适中。

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Research on Quality Standard of Lusun Tablets

MA Jing,FEI Xiaofan,LI Wenyao,SONG Yi

(Dept.of Clinical Pharmacy,West China Hospital of Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041,China)

OBJECTIVE：To establish a method for quality control of Lusun tablets. METHODS:TLC was used to make a thin-layer qualitative identification for aspartic acid in Lusun tablets. RP-HPLC was adopted to determine the content of aspartic acid in Lusun tablets. The sample was derived with 2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB). Aspartic acid was separated on Chromsil ODS (250 mm×4.6 mm,5 μm) column at the flow rate of 1.0 ml/min. The mobile phase used was a mixture of A containing 50 mmol/L sodium acetate buffer(pH=6.4) and phase B containing 50% acetonitrile-water through the gradient elution. The detection wavelength was set at 360 nm and the column temperature was 35 ℃. RESULTS: Aspartic acid had good linearity in the ranges of 0.154 μg-2.044 μg,r=0.999 9. The average recovery was 98.98%,RSDwas 1.23%. CONCLUSIONS: The method is accurate,sensitive,reproducible and credible to determine the content of aspartic acid in Lusun tablets,and provides the oretical basis for the quality control of Lusun tablets.

DNFB; Pre-column derivatization; Aspartic acid; TLC；RP-HPLC; Lusun tablets

R927.11

A

1672-2124(2017)08-1085-04

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.08.030

2017-01-25)

*中药师，执业中药师。研究方向：中药材、中药成方制剂的质量控制和研发工作。E-mail：mandy23@163.com

#通信作者：主任药师。研究方向：中、西药新制剂的研发工作。E-mail： yisong.scu@foxmail.com