酪酸梭菌对RSV感染加重的哮喘小鼠气道炎症的影响

2017-08-29 02:16郭颖张娟曾明华
中国医药科学 2017年15期
关键词:支气管哮喘小鼠

郭颖 张娟 曾明华

[摘要] 目的 酪酸梭菌对RSV感染的哮喘小鼠模型气道的炎症反应的影响。 方法 6~8周龄雄性BALB/c小鼠36只,随机分为对照组(NC)、模型组(PC)、酪酸梭菌治疗组(LS),每组12只。除对照组(NC)以外,其余各组均采用卵清蛋白腹腔注射致敏和雾化吸入激发,建立小鼠哮喘模型,在哮喘模型建立后第二日用RSV隔日滴鼻,连续3次,复制急性病毒感染哮喘模型。对照组(NC)采用生理盐水替代卵清蛋白和RSV。酪酸梭菌组(LS)于0~33天给予酪酸梭菌灌喂,每日1次,第34天计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中的白细胞数目;制作肺组织的病理切片,进行HE染色和Masson染色,观察肺组织病理变化;酶联免疫吸附法(ELISA)检测BALF与血清中细胞因子IFN-γ、BALF中IL-12、IL-5及血清中嗜酸性粒细胞趋化因子。 结果 与模型组(PC)相比,酪酸梭菌组(LS)小鼠BALF中白细胞总数明显降低(P<0.01),BALF及血清中细胞因子IFN-γ、IL-12的水平升高(P<0.01),嗜酸性粒细胞趋化因子、IL-5水平降低(P<0.01)。 结论 酪酸梭菌可减轻RSV感染的哮喘小鼠气道炎症,酪酸梭菌对于RSV感染的哮喘小鼠具有一定的治疗作用。

[关键词] 酪酸梭菌;支气管哮喘;卵清蛋白;小鼠

[中图分类号] R562.25 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616(2017)15-31-06

[Abstract] Objective To explore the effect of Clostridium butyricum to aggravate airway inflammation in asthmatic mice infected with RSV. Methods 36 mice of 6-8 week old male BALB/c were randomly divided into control group(NC),model group(PC) and Clostridium butyricum treatment group(LS) with 12 mice in each.Except the control group(NC),all the other groups were treated with ovalbumin,intraperitoneal injection,sensitization and inhalation,the mouse asthma model was established.After the asthma model was established,second day RSV nasal drops were taken every other day for 3 times.The acute viral infection asthma model was copy.The control group(NC) was treated with normal saline instead of ovalbumin and RSV.Clostridium butyricum group(LS) in 0-33 days with Clostridium butyricum were fed 1 times a day,the number of leukocytes in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) was counted for thirty-fourth days.Pathological sections of lung tissue were made and HE staining and Masson staining were used to observe the pathological changes of lung tissue.Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect BALF and serum levels of cytokines IFN-γ,IL-12,BALF,IL-5,and eosinophils in serum. Results Compared with the model group(PC),clostridium butyricum group(LS) the total number of white blood cells in BALF mice decreased significantly(P<0.01),the BALF and serum levels of cytokines IFN-,gamma,and IL-12 were elevated(P<0.01),and the levels of eosinophils,chemokines and IL-5 decreased(P<0.01). Conclusion Clostridium butyricum can alleviate the airway inflammation of asthmatic mice infected with RSV.Clostridium butyricum has certain therapeutic effect for RSV infection in asthmatic mice.

[Key words] Clostridium butyricum;Bronchial asthma;Ovalbumin;Mice

支氣管哮喘是一种常见的气道慢性炎症性疾病,全球目前有3亿多哮喘患者,并以每10年增加50%的速度递增[1-2]。呼吸道合胞病毒(RSV)是引起哮喘急性发作与加重的主要原因,近80%的儿童

哮喘急性发作或加重与呼吸道病毒感染有关[3]。其机制可能与气道高反应性、T细胞活化、趋化因子分泌增加、全身免疫激活和气道局部炎症反应等相关[4]。在哮喘的临床治疗上糖皮质激素、β2受体激动剂等已被广泛成熟的应用,一些微生态制剂的应用是儿童哮喘治疗的新思路,实验证明取得了一定的疗效,但是关于益生菌对于RSV加重的哮喘的作用少有研究。

酪酸梭菌(costridium butyricum)又称酪酸梭状芽胞杆菌,具有极强的整肠作用,它可抑制肠道中的致病菌,促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长[5-6]。此前我们课题组研究证明,酪酸梭菌可以通过抑制过敏诱导的Th2细胞因子和OVA特异性IgE及IgG1的产生、降低小鼠BALF中炎细胞总数、改善肺部病理变化减轻哮喘小鼠气道炎症[7]。因此,本实验目的在于进一步研究酪酸梭菌对RSV感染加重的哮喘小鼠气道炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

卵清蛋白OVA(美国Sigma公司),氢氧化铝(天津市天力化学试剂公司) ,酪酸梭菌(山东科兴生物制品有限公司),Hep-2细胞株(西京医院儿科实验室),呼吸道合胞病毒A亚型(首都儿科研究所),空压雾化器(欧姆龙大连有限公司)。

1.2 病毒的细胞培养

在含10%胎牛血清的中培养Hep-2细胞,培养箱条件为37℃、5%CO2,待细胞铺满单层约70%后,将RSV病毒原液接种于Hep-2细胞。维持在原条件下继续培养,3~5d即可出现细胞病变效应,待病变达80%以上收集病毒。采用TDID50测定病毒滴度。收集培养瓶中细胞悬液,在-80℃冰箱和37℃水浴反复冻融3次,离心后收集上清悬液,保存于-80℃冰箱中冻存备用[8]。

1.3 实验动物与分组

36只8周龄SPF级BALB/c雄性小鼠,体重(20±2)g,购自第四军医大学实验动物中心,饲养于第四军医大学基础部动物房,随机分为三组,每组12只,分别为对照组(NC组)、模型组(PC组)、酪酸梭菌治疗组(LS组),用不含OVA的颗粒饲料喂养,自由饮水。整个过程遵守《实验动物管理条例》。

1.4 模型的建立

实验第0天、第7天和第14天给予模型组(PC组)、酪酸梭菌治疗组(LS组)小鼠腹腔注射致敏液0.2mL(含100μg OVA及1.5mg Al(OH)3)进行致敏。对照组(NC组)小鼠采用生理盐水溶液,注射部位及剂量与实验组相同。实验第21~28天给予PC组、LS组用含1%的OVA溶液作为雾化液激发。方法是将PC组、LS组两组小鼠放在5L自制的密闭容器中,使小鼠暴露在1%OVA气雾中,每日1次,每次30min。第29、31天每日给予上述1%OVA雾化;第28、30、32天给予體积100μL RSV上清液鼻腔滴入,共3次。待滴鼻第4天小鼠出现毛发竖立、无光泽,烦躁不安或精神萎靡,颤动或点头、咳嗽及呼吸加深、节律性收腹样喘促等阳性反应,表明RSV感染小鼠模型建立成功。对照组以生理盐水代替OVA雾化激发和鼻腔滴入,频次及时间同上。LS组于实验第0~33天采用酪酸梭菌溶液进行灌胃(酪酸梭菌浓度5×108CFU/mL,即5g菌粉溶于10mL生理盐水混匀后分装,灌胃时每只小鼠0.2mL,-4℃保存。)其他两组均采用等量生理盐水代替酪酸梭菌溶液灌胃。

1.5 细胞因子检测

在末次激发24h后处死小鼠,立即摘眼球取血,4℃、4000r/min,离心10min获取血清。用自制穿刺针进行气管插管并固定,用0.8mL灭菌的冷 PBS 溶液进行支气管肺泡灌洗,10s后回抽,重复3次(回抽率>80%),将回抽的BALF于4℃,2500r/min,离心5min,收集上清液[9]。ELISA试剂盒检测小鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-5、IL-12及嗜酸性粒细胞趋化因子。具体步骤按照试剂盒说明书进行。用1mL无菌PBS溶液重悬离心后的沉淀,取0.1mL重悬液进行白细胞计数。

1.6 小鼠肺组织病理学变化的观察

取各组小鼠的肺组织,按照H-E染色操作常规,经福尔马林固定、脱蜡回水、包埋、切片后,分别观察气道周围嗜酸粒细胞、气道黏液分泌物及气道周围胶原增生的变化。

1.7 统计学处理

实验采用SPSS17.0统计软件,数据用()表示,符合正态分布且方差齐者,多组间比较采用One-Way ANOVA法,组间两两比较采用LSD法;数据不符合正态分布者,多组间比较采用Kruskal-WallisH检验,组间两两比较采用 Mann-Whitney U检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RSV与Hep-2细胞孵育后的变化

未感染RSV的Hep-2细胞贴壁生长,形成单层铺路石样细胞,排列规则紧密,互相嵌合成多边形;RSV感染细胞后,出现细胞变圆、拉长及融合现象,镜下可见细胞边界不清,病变细胞相互融合呈“多核巨细胞”的合胞体,见图1。

2.2 肺组织病理变化

肺组织HE染色显示,NC组小鼠气道周围炎性细胞浸润较少,肺泡壁完整,PC组小鼠肺组织炎性细胞浸润明显增多,肺泡腔明显狭窄,肺泡壁断裂,LS组小鼠肺组织炎症较模型组明显减轻,炎症细胞浸润显著减少,偶见肺泡壁断裂及管腔狭窄。见图2。Masson染色结果显示,NC组小鼠气道周围胶原纤维沉积较少;PC组小鼠气道周围胶原纤维明显增多;LS组小鼠气道周围胶原纤维沉积减少。见图3。

2.3 BALF的炎症细胞变化

与NC组小鼠相比,PC组小鼠BALF中白细胞分类计数中主要表现为嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及巨噬细胞的升高;LS组小鼠 BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及巨噬细胞明显降低(P<0.01)。见图4。

2.4 各组小鼠血清与BALF中IFN-γ、IL-12的检测结果

与NC组相比,PC组小鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-12水平明显降低(P<0.01),LS组IFN-γ、IL-12可以明显升高(P<0.01)。见图5~6。

2.5 各组小鼠血清中嗜酸性粒细胞趋化因子、IL-5含量

与NC组相比,PC组小鼠血清和BALF中嗜酸性粒细胞趋化因子、IL-5水平明显升高(P<0.01),酪酸梭菌可以降低哮喘小鼠嗜酸性粒细胞趋化因子与IL-5水平(P<0.01),见图7~8。

3 讨论

支气管哮喘(bronchial asthma)是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。经典免疫学说认为,哮喘发病机制主要与Th1/Th2功能失衡相关,当哮喘发作时,Th2细胞功能亢进,可分泌大量细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等,促进炎症反应。Th1可引发吞噬细胞介导的宿主防御应答,主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等,减少炎症反应[10-11]。因此许多学者认为通过提高Th1细胞功能可达到抑制亢进的Th2反应,从而达到预防和治疗哮喘的目的。IL-12是调节Th1分化的主要细胞因子:一方面,IL-12诱导Th1分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子,加强了由它们介导的细胞免疫;另一方面,IL-12可抑制由Th2分泌IL-4、IL-5介导的体液免疫和IgE的升高,从而抑制哮喘的发生[12-13]。哮喘是一种以嗜酸粒细胞浸润为特征的气道炎症性疾病[14],嗜酸性粒细胞趋化因子是组织嗜酸性粒细胞增多的主要调解者,促炎细胞因子TNF-α和Th2型细胞因子IL-4各自誘导嗜酸性粒细胞趋化因子产生,并且它们的组合引起该产生显著协同作用[15]。

呼吸道合胞病毒是婴幼儿最为常见的呼吸道感染病原体[16-17]。由于RSV对气道上皮细胞的破坏,导致由气道成纤维细胞分泌的细胞因子增多引起炎性细胞启动聚集,并抑制其凋亡[18],使气道重构加重,故加重哮喘发作。在我国各地,RSV每年都有流行,是导致急性下呼吸道感染的重要病原体[19]。

益生菌是一类在适当的摄入数量时会对宿主机体带来益处的活体微生物[20]。酪酸梭菌是人体内有益菌之一[21-22]。近年来研究发现,益生菌制剂不仅可以用于治疗消化道疾病,而且有降低炎症介质、抗菌和提高机体免疫力的作用,在肺部感染和危重疾病等呼吸道疾病的治疗方面的研究取得了较大的进展,给呼吸系统疾病的治疗研究指出了新的研究方向[23]。

本实验结果显示,口服酪酸梭菌可降低RSV感染的哮喘小鼠血清和BALF中炎细胞总数、改善肺部病理变化,在一定程度上诱导RSV感染的哮喘小鼠分泌Th1细胞因子IFN-γ、IL-12上调,降低嗜酸性粒细胞趋化因子,减轻轻哮喘小鼠气道炎症,进一步推测酪酸梭菌作为一种常见的益生菌,对RSV感染的哮喘疾病有免疫调节和抗炎作用,能够减轻炎症反应,调节Th1/Th2细胞平衡,达到辅助防治哮喘的作用,但其临床应用及其机制仍需进一步研究。

[参考文献]

[1] Masoli M,Fabian D,Holt S,et al.The global burden of asthma:executive ummary of the GINA Dissemination Committee report[J].Allergy,2004,59(5):469-478.

[2] Machura E,Mazur B,Rusek-Zychma M,et al.Cytokine production by peripheral blood CD4+and CD8+T cells in atopic childhood asthma[J].Clin Dev Immunol,2010, 2010:606139.

[3] Kumar A,Grayson M H.The role of viruses in the development and exacerbation of atopic disease[J].Ann Allergy ASthma Immunol,2009,103:181-186.

[4] 李昌崇,苏苗赏.呼吸道合胞病毒致毛细支气管炎与支气管哮喘的关系及诊断治疗策略[J].实用儿科血杂志,2006,21(16):1045-1047.

[5] Skermanvbd,Mcgowanv,Sneathpha.Appmved fistsof bacterial names[J].Int J Syst Ihcteriol,1980,30:225420.

[6] Przamowski A.Untersuchung fiber die Entwickelungsgeschichte und Fermentwirking einiger Bacterien-Arten[M].Leipzig:Inaugural Dissertat Hugo Voigt,1880:158.

[7] 张娟,魏春,孙新,等.口服酪酸梭菌减轻哮喘小鼠气道炎症的研究[J].山西医科大学学报,2015,46(11):1083-1087.

[8] 刘瑞清,张国成,黄可飞,等.重组人干扰素α1b对呼吸道合胞病毒感染小鼠外周T淋巴细胞亚群及肺组织病理学的影响[J].2013,13(9):1639-1644.

[9] 张娟.酪酸梭菌对哮喘小鼠气道炎症及气道重塑防治作用的研究[J].陕西:第四军医大学,2016.

[10] 胡亚美,诸福棠实用儿科学[M].北京市朝阳区潘家园南里19号,人民卫生出版社,2016,706-722.

[11] 邹毅,终南山.呼吸道合胞病毒与支气管哮喘[J].国外医学呼吸系统分册,2002,22(1):42-44.

[12] leonard P,Sur S.Interleukin-12:potential role in asthma therapy[J].BioDrugs,2003,17(1):1-7.

[13] Shida K,Kiyoshima Shibata J,Nagaoka M,et al.Nanno M(2006)Induction of interleukin-12 by Lactobacillus strains having a rigid cell wall resistant to intracellular digestion[J].Dairy Sci 89:3306-3317.

[14] Aeffner F,Davis IC.Respiratory syncytial virus reverses airway hyperresponsiveness tomethacholine inovalbumin-sensitized mice[J].Plos One,2012,7:e46660.

[15] Zhu W,Bi M,Liu Y,et al.Thrombin promotes airway remodeling via protease-activated recepror-1 and transforming growth factor-β1 in ovalbumin-allergic rats[J].Inhal toxicol,2013,25(10):577-586.

[16] 朱汝南.2000年秋冬至2002年夏北京地區急性呼吸道感染病毒病原学研究[J].临床儿科杂志,2002,45:18-24.

[17] Lee GG,Yoon HJ,Zhu Z,et al.Respiratory Syncytial virus stimulation of vascular end othelial cell growth Factor/Vascular permeability factor.Am[J].Respir cell Mol Biol,2000,23:662-669.

[18] Zhang Q Mohammed. A cell-cultures from bronchial subepithelial myofibrob lasts enhance eosinophil survival in vitro[J].Eur Respir J 1996,9(9):1839-1846.

[19] 张晓波,陆爱珍,王立波,等.儿童变态反应性疾病相关因素研究[J].临床儿科杂志,2007,25(9):755-758.

[20] 吴江,吴正钧,郭本恒.益生菌辅助防治过敏性疾病的研究进展[J].微生物学通报,2013(2):279-286.

[21] 张灼阳,刘畅,郭晓奎.益生菌的安全性[J].微生物学报,2008(2):257-261.

[22] 王文建,郑跃杰,国内益生菌制剂临床应用状况分析[J].中国微生态学杂志,2009(1):70-72.

[23] 李健,刘大鹰.微生态制剂在呼吸和危重症疾病中的应用进展[J].重庆医学,2014(6):740-742.

(收稿日期:2017-05-09)

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