山楂叶提取物中牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷对照品的制备

文蕾, 林云良, 高红梅, 李峰, 姜姣姣, 宋祥云, 付瑞明, 王岱杰*

(1. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2. 山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南 250014)

山楂叶提取物中牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷对照品的制备

文蕾1, 林云良2, 高红梅2, 李峰2, 姜姣姣1, 宋祥云2, 付瑞明2, 王岱杰2*

(1. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2. 山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南 250014)

采用高速逆流色谱结合半制备液相色谱技术快速分离山楂叶中低含量的牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷单体。以氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)为溶剂系统，流速为5.0 mL/min，转速为850 r/min，检测波长为254 nm，从山楂叶黄酮提取物中富集得到含牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷3种化合物的混合组分，经半制备液相进行二次分离纯化，得到纯度大于98%的牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷单体。研究结果表明，该技术对山楂叶中低含量黄酮类化合物的分离快速、高效，且纯度高。

山楂叶；牡荆素；金丝桃苷；异槲皮苷；高速逆流色谱；半制备液相色谱

山楂叶(Crataegi Folium)为蔷薇科(Rosaceae)植物山里红(CrataeguspinnatifidaBge.Var.majorN. E. Br.)或山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥叶，具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂等多种功效，在我国山东、陕西、山西等地均广泛分布[1]。山楂叶作为山楂果实的副产物，资源丰富、产量高，具有广泛的开发价值。现代药理研究表明，山楂叶具有降血脂、抗心肌缺血缺氧、防治糖尿病、抗炎和镇痛等多种药理活性[2-5]，已广泛地应用于山玫胶囊、益心酮片等多种中成药中。牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷为黄酮类化合物，是《中国药典》中规定的山楂叶、山楂叶提取物及相关制剂的检测指标[6]。这3种成分在山楂叶中含量较低，采用聚酰胺柱聚酰胺色谱、硅胶柱色谱和Sephadex LH-20柱色谱等传统制备方法，具有分离时间长、重现性差、死吸附严重、溶剂消耗量大等问题[7-14]。

为了克服上述缺点，我们运用高速逆流色谱结合半制备液相色谱技术，对山楂叶中含量较低的牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷3种黄酮类成分进行分离纯化，得到高纯度的单体，为进一步开发山楂叶资源提供了技术支持。3种化合物化学结构式见图1。

图1 山楂叶中3种黄酮类化合物的结构式Fig.1 Chemical structures of 3 flavonoids from leaves of Crataegi Folium

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料

TBE-300C高速逆流色谱仪(上海同田生物技术股份有限公司)；8823A紫外检测器(北京艾美林科技有限公司)；TBP-5002输液泵(上海同田生物技术股份有限公司)；3057便携式记录仪(重庆川仪总厂有限公司)；DC-0506恒温水浴槽(上海同田生物技术股份有限公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters)；半制备用仪器采用LC-3000液相色谱系统(北京普源精电科技有限公司)；SB-5200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

实验用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇为分析纯(国药集团药业股份有限公司)；高效液相色谱仪用乙腈为色谱纯(美国Fisher)，水为娃哈哈纯净水。

山楂叶黄酮提取物(陕西昊辰生物科技有限公司)，黄酮质量分数为80%。

1.2 两相溶剂体系及样品溶液的制备

本实验中高速逆流色谱所用溶剂体系为氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)，按比例将4种溶剂置于2 L分液漏斗中，充分震荡，静置分层，上相为固定相，下相为流动相，使用前超声波脱气。

取山楂叶黄酮提取物800 mg，用上下相各15 mL溶解。

1.3 分配系数KD值的测定

取2 mg山楂叶总黄酮样品置于2 mL试管中，加入2 mL下相，取5 μL溶液注入HPLC检测，记录相应峰的峰面积为A1。加入2 mL上相于试管中，充分震荡，静置分层，取下相溶液5 μL注入HPLC，记录相应的峰面积为A2，KD= (A1-A2)/A2[15]。

1.4 高速逆流色谱分离

将高速逆流色谱溶剂体系的上相以30 mL/min注入仪器的分离柱聚四氟乙烯管中，启动仪器至850 r/min，以5.0 mL/min泵入流动相，当达到流体动力学平衡，即流动相从出口流出，无固定相流出时，将样品溶液注入仪器的进样圈，开启记录仪和检测器，检测波长设为254 nm，依据检测器的色谱图手动收集流出液。

1.5 半制备液相色谱制备

将含有牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷3种黄酮类成分的样品使用流动相溶解，YMC采用YMC C18色谱柱(10.0 mm×250 mm, 5 μm)进行二次制备，流动相为乙腈-水(19∶81，V/V)，流速3.0 mL/min，检测波长254 nm。

1.6 HPLC分析和结构鉴定

山楂叶提取物、高速逆流色谱及半制备液相色谱所得各组分均采用HPLC进行分析。色谱柱为Waters XBridge BEH C18柱(100 mm × 4.6 mm, 2.5 μm)，检测波长254 nm；流速1.0 mL/min；洗脱溶剂为乙腈和水，梯度条件为：0～3 min，13%～14%乙腈；3～15 min，14%～17%乙腈；15～15.1 min，17%～13%乙腈；15.1～20 min，13%乙腈。

2 结果与分析

2.1 HPLC条件优化

本文分别考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水作为流动相，梯度和等度液相条件洗脱对样品分离的效果。研究结果表明，当采用乙腈-水进行梯度洗脱，梯度条件为：0～3 min，13%～14%乙腈；3～15 min，14%～17%乙腈；15～15.1 min，17%～13%乙腈；15.1～20 min，13%乙腈时，各组分可以得到良好的分离。

2.2 HSCCC分离条件的优化及上样量的考察

本文分别考察了不同比例的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5，V/V)、正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1∶1.6∶1∶1.6，V/V)、乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶1∶5，V/V)、氯仿-甲醇-水(4∶3∶2，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶0.5，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶2，V/V)体系对高速逆流色谱分离的影响。结果表明，当采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5，V/V)、正己烷-乙酸乙酯-乙醇V水(1∶1.6∶1∶1.6，V/V)、乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶1∶5，V/V)体系时， 牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷主要集中于下相，3种化合物被快速洗脱出，未能实现有效的分离。当采用氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶0.5，V/V)体系时，3种化合物洗脱时间过长，分离效率较低。增加正丁醇的含量，洗脱时间缩短，当正丁醇增至氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶2，V/V)时，溶液不能分层，无法进行分离。当正丁醇降至氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)时，3种化合物可以与其他色谱峰实现良好的分离，但由于3种化合物的KD值接近，即使调整逆流色谱分离的流速或者转速，3种化合物色谱峰均被同时洗脱出出来，见图2。因此，本文采用半制备液相色谱对3种化合物进行二次分离制备。

图2 山楂叶总黄酮的高速逆流色谱图Fig.2 Chromatogram of total flavonoids from Crataegi Folium by HSCCC

本文基于分离效率考察了不同上样量的山楂叶总黄酮提取物对逆流色谱分离的影响，结果表明，上样量增加至800 mg时，仍可以实现牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷3个峰与其他色谱峰的逆流色谱分离，得到含有上述3种化合物的混合物98.6 mg。

2.3 半制备液相色谱分离

本实验考察了不同比例的乙腈-水体系对牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷3种化合物分离效率的影响，结果表明，当采用YMC C18色谱柱(10.0 mm×250 mm, 5 μm)进行二次制备，流动相为乙腈-水(19∶81，V/V)，流速3.0 mL/min，检测波长254 nm时，3种化合物可以实现基线分离，最终制备得到3种化合物的纯度均高于98%。制备图见图3，液相色谱图见图4。

图3 逆流色谱粗分物的半制备液相分离色谱图Fig.3 Chromatogram of pre-HPLC of total flavonoids separated by HSCCC

图4 山楂叶中黄酮类化合物的HPLC分析图Fig.4 HPLC chromatogram of flavonoids from Crataegi Folium

2.4 结构鉴定

化合物1：ESI-MS,m/z433.3 [M+H]+, 431.1 [M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 13.16( 1H, s, 5-OH), 6.90 (2H, d,J=6.4 Hz, H-3′, 5′), 6.77 (1H, s, H-3), 6.26 (1H, s, H-6), 4.69 (1H, d,J=9.9 Hz, H-1″)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 181.7 (C-4), 163.7 (C-2), 162.7 (C-7), 161.0 (C-5), 160.3 (C-4′), 156.5 (C-9), 129.6 (C-2′), 128.8 (C-6′), 121.5 (C-1′), 115.7 (C-3′), 115.7 (C-5′), 104.7 (C-8), 104.1 (C-10), 102.4 (C-3), 98.2 (C-6), 81.7 (C-5″), 78.5 (C-3″), 73.3 (C-1″), 70.8 (C-2″), 70.4 (C-4″), 61.1 (C-6″)。与文献[16]的数据进行比对，鉴定为牡荆素。

化合物2：ESI-MS,m/z465.2 [M+H]-, 463.1 [M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.64 (1H, s, 5-OH), 10.84 (1H, s, 7-OH), 7.67 (1H, dd,J=2.0, 8.4 Hz, H-6′), 7.54 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.82 (1H, d,J=8.4 Hz, H-6′), 6.41 (1H, d,J=1.6 Hz, H-8), 6.20 (1H, d,J=1.6 Hz, H-6), 5.38 (1H, d,J=8.0 Hz, H-1″)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.3 (C-4), 164.5 (C-7), 161.1 (C-5), 156.2 (C-9),156.1 (C-2), 148.4 (C-4′), 144.7 (C-3′), 133.4 (C-3),121.9 (C-6′), 121.0 (C-1′), 115.8 (C-5′), 115.1 (C-2′), 103.7 (C-10), 101.8 (C-1″), 98.7 (C-6), 93.5 (C-8), 75.7 (C-5″), 73.1 (C-3″), 71.1 (C-2″), 67.8 (C-4″), 60.0 (C-6″)。与文献[17]的数据进行比对，鉴定为金丝桃苷。

化合物3：ESI-MS,m/z463.2 [M-H]-.1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.75 (1H, s, 4′-OH), 7.58 (1H, dd,J= 6.0, 2.0 Hz, H-6′), 7.57 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2′), 6.89 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5′), 6.41 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 6.21 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6), 5.46 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1″)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.8 (C-4), 164.7 (C-7), 161.7 (C-5), 156.8 (C-9), 156.5 (C-2), 148.9 (C-4′), 145.3 (C-3′), 133.7 (C-3), 122.0 (C-6′), 121.6 (C-1′), 116.6 (C-5′), 115.7 (C-2′), 103.7 (C-10), 101.4 (C-1″), 99.2 (C-6), 94.0 (C-8), 77.9 (C-5″), 76.8 (C-3″), 74.5 (C-2″), 70.3 (C-4″), 61.3 (C-6″)。与文献[18]的数据进行比对，鉴定为异槲皮苷。

3 讨论

本文采用高速逆流色谱结合半制备液相色谱技术，对山楂叶中含量较低的牡荆素、金丝桃苷、异槲皮苷3种黄酮类成分进行分离纯化，得到高纯度的单体。研究结果表明，高速逆流色谱具有样品无损失、无污染、高效、快速、粗提物进样、大制备量分离和重现性好等优点，适合于复杂组分样品的前处理和富集。制备液相色谱具有分离效率高、重现性好等优势，而对组分较杂的样品，该方法分离效率较低，样品前处理严格。在本研究中将逆流色谱作为富集手段，增大了样品上样量，极大提高了富集效率。同时，结合制备液相色谱技术，实现了低含量化合物的快速制备。采用高速逆流色谱与制备液相色谱技术结合，可发挥二者的优势，为复杂样品中高纯度化合物的分离提供参考。

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Preparation of reference substances of vitexin, hyperoside and isoquercitrin from Crataegi Folium extract

WEN Lei1, LIN Yun-liang2, GAO Hong-mei2, LI Feng2, JIANG Jiao-jiao1, SONG Xiang-yun2, FU Rui-ming2, WANG Dai-jie2*

(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. Shandong Analysis and Test Center,Shandong Provincial Key Laboratory of TCM Quality Control, Jinan 250014 China)

∶Three low content flavonoids, such as vitexin, hyperoside and isoquercitrin from Crataegi Folium were rapidly separated and purified by high-speed counter-current chromatography (HSCCC) combined with pre-HPLC. The total flavonoids from Crataegi Folium were firstly separated by HSCCC, with a solvent system of chloroform/methanol/water/n-butanol (4∶3∶2∶1.5,V/V), flow-rate of 5.0 mL/min, rotation speed of 850 r/min, detection wavelength of 254 nm. A mixed component was separated from crude flavonoids, containing vitexin, hyperoside, and isoquercitrin. Then, the mixture was separated by pre-HPLC and vitexin, hyperoside, and isoquercitrin were obtained, with the purity over 98%, respectively, as determined by HPLC. Experimental results show that it is an efficient method for separation of low content flavonoids with high purities from Crataegi Folium by HSCCC combined with pre-HPLC.

∶Crataegi Folium; vitexin; hyperoside; isoquercitrin; HSCCC; pre-HPLC

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.003

2017-03-21

国家自然科学基金((81473298, 21506119)；山东省科技发展计划(2014GZX219003)；山东省三院联合基金(ZR2016YL006)

文蕾 (1992—)，女，硕士研究生，研究方向为天然产物分离纯化与活性研究。

*通信作者，王岱杰。E-mail: wangdaijie@126.com

R284.2

A

1002-4026(2017)04-0013-06