土壤杆菌固氮、溶磷活性及对植物的促生作用

魏艳丽，Maarten RYDER ，李纪顺，李玲，杨玉忠，杨合同,3*

(1. 山东省科学院生态研究所，山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250014； 2. 澳大利亚阿德莱德大学农业食品葡萄酒学院，阿德莱德 5064；3. 山东省黄河三角洲可持续发展研究院，山东 东营 257000)

【农业微生物】

土壤杆菌固氮、溶磷活性及对植物的促生作用

魏艳丽1，Maarten RYDER2，李纪顺1，李玲1，杨玉忠1，杨合同1,3*

(1. 山东省科学院生态研究所，山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250014； 2. 澳大利亚阿德莱德大学农业食品葡萄酒学院，阿德莱德 5064；3. 山东省黄河三角洲可持续发展研究院，山东 东营 257000)

通过选择性培养基，定性和定量检测了26株土壤杆菌的固氮和溶磷活性，通过盆栽检测了澳洲生防菌株K1026对黄瓜和小麦的促生长作用。结果显示，包括致病性和无致病性的26株土壤杆菌均可在无氮培养基上正常生长；其中19株具有溶磷活性， K1026对磷酸钙液体培养基的溶磷量为109.11 μg/mL；对黄瓜幼苗根系生长具有显著促进作用，但对小麦生长没有明显影响。

土壤杆菌；AgrobacteriumrhizogenesK1026；固氮；溶磷；促生作用

土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)K1026通过产生土壤杆菌素A84和A434[1]，对致病性土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)侵染引起的冠瘿病具有较好的防治效果，已广泛应用于核果类果树冠瘿病的生物防治中[2]。目前对生防菌株K1026的研究主要集中于对核果类果树冠瘿病的防治作用和作用机理方面[3-4]，而在其固氮、溶磷和促生作用方面鲜有报道。本文初步检测了26株土壤杆菌的固氮和溶磷活性，并研究了生防菌株K1026对黄瓜和小麦幼苗生长的影响，以期为开发高效微生物菌肥提供种质资源，也为菌株K1026的田间应用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试菌株和植物

1.1.1 供试菌株

生防菌株K1026由澳大利亚阿德莱德大学Maarten Ryder教授提供，属于非致病性发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。25株致病性土壤杆菌(A.rhizogenes)如S-30、K108等由本实验室分离自山东泰安大樱桃根癌组织和感病土壤中，可侵染樱桃根部产生根癌组织。参比菌株为越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderiavietnamiensis)B418，保存于本实验室，已验证具有固氮、溶磷和促生活性[5]。

1.1.2 供试植物

供试黄瓜品种为中农16号；供试小麦品种为济麦22号。

1.2 培养基

1.2.1 YMA培养基

K2HPO40.5 g/L；CaCl20.2 g/L；NaCl 0.2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；酵母浸粉 1 g/L；甘露醇 10 g/L；微量元素(1 000×)2 mL，固体培养基加入琼脂 15 g/L，调整pH至 7.2～7.4，121 ℃灭菌 20 min。其中微量元素(1 000×)的配方为：FeCl35 g/L；MnCl20.1 g/L；ZnCl20.5 g/L。

1.2.2 无氮培养基

KH2PO40.2 g/L；CaCO35.0 g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；NaCl 0.3 g/L；甘露醇 10 g/L；CaSO4·2H2O 0.1 g，琼脂 15 g/L，调整pH=7.0，121 ℃灭菌 20 min。

1.2.3 Pikovskaya 培养基[6]

葡萄糖 10 g，酵母粉 0.5 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，磷酸钙 5.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH为7.0～7.5，琼脂 15 g，121 ℃灭菌 20 min。

1.3 方法

1.3.1 土壤杆菌固氮能力定性检测

将包括菌株K1026在内的26株土壤杆菌经YMA培养基活化后，分别用灭菌牙签点接于无氮固体培养基上，26 ℃培养3 d后检测菌株生长情况。

1.3.2 土壤杆菌溶磷活性测定

溶磷能力定性实验采用点接Pikovskaya培养基的方法，将26株土壤杆菌经YMA活化后，分别用灭菌牙签点接于Pikovskaya 培养基上，26 ℃培养4～7 d后，测量溶磷圈直径。

参考Li等[7]方法进行定量实验，挑选溶磷能力强的菌株，在YMA培养基上培养48 h，然后用无菌水洗下培养物制备菌悬液，按质量分数1%的接种量接种于液体Pikovskaya培养基中，26 ℃、170 r/min摇床培养7 d。采用磷钼蓝分光光度法测定并计算发酵液中可溶性磷的含量，以灭菌后未接种的空白 Pikovskaya液体培养基作为对照。

1.3.3 生防菌株K1026对黄瓜和小麦幼苗生长的影响

实验在山东省科学院生态研究所温室中进行。实验用土为普通蔬菜地土壤加质量分数为30%的河沙，充分混匀。将K1026和B418菌株分别在YMA和B418培养基上培养48 h ，然后分别用无菌水洗下菌体，调整菌悬液浓度为5×108CFU/mL。用以上两种菌悬液分别浸泡黄瓜和小麦种子2 h，同时设清水浸种对照。每盆播种8粒，待黄瓜和小麦分别长出4片叶后，每盆定苗4株。分别于播种后6～7 d调查出苗率，42 d后测定幼苗生长指标，包括根长、株高、根部鲜重(干重)和整株鲜重(干重)。

1.3.4 数据分析

采用Excel 2007进行数据统计分析，用Ducan’s方差分析，差异显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 土壤杆菌在无氮培养基上的生长

检测了包括K1026在内的26株土壤杆菌在无氮培养基上的生长情况，结果发现，无论是致病性土壤杆菌还是生防菌K1026，所有26株菌在无氮培养基上均可正常生长。

2.2 土壤杆菌的溶磷活性

检测的26株土壤杆菌在Pikovskaya固体培养基上培养7 d，其中19株可观察到明显的溶磷圈(图1)，溶磷圈直径1.08～1.22 cm之间。

采用磷钼蓝分光光度法，定量检测了3株土壤杆菌的溶磷活性，发现26 ℃摇床培养72 h，测试的3株土壤杆菌均具有较好的溶磷效果。其中生防菌K1026发酵液中可溶磷含量可达到109.11 μg/mL，病原菌S-30发酵液中可溶磷含量达140.11 μg/mL，土壤杆菌K108发酵液中可溶磷含量最高，为162.18 μg/mL(图2)。

图1 部分土壤杆菌的溶磷活性Fig.1 Phosphate solubilizing activity of Agrobacterium strains.

图2 部分土壤杆菌的溶磷活性定量检测Fig.2 Quantitative determination of phosphate solubilizing activity of 3 strains in liquid medium

2.3 生防菌株 K1026对黄瓜幼苗生长的影响

由表1可知，与对照相比添加土壤杆菌K1026的处理黄瓜根的长度增加25.49%，根部干重增加62.96%，均达到差异显著水平；但株高和地上部分干重两个指标与对照无显著性差异。伯克霍尔德氏菌B418处理的黄瓜种子，除能增加株高外，其他指标与对照均无显著性差异。

表1 不同菌剂处理对黄瓜幼苗生长的影响

注：同列数据后不同小写字母表示经LSD检验在P<0.05水平上差异显著。

2.4 生防菌株 K1026对小麦幼苗生长的影响

生防菌株K1026对小麦根系生长没有明显的影响，对整株生长的促进作用也较小；而B418对小麦生长有促进作用，与对照水处理相比，对根系干重的增长率为26.32%，对植株地上干重增长率达到6.12%，见表2。

表2 不同菌剂处理对小麦幼苗生长的影响

注：同列数据后不同小写字母表示经LSD检验在P<0.05水平上差异显著。

3 讨论

土壤杆菌(Agrobacterium)在分类学上属于根瘤菌科(Rhizobiaceae)，一直被认为由于不固定氮而区别于根瘤菌和其他自生固氮菌[8-9]。本文检测的26株土壤杆菌均可以在无氮培养基上正常生长，初步推测固氮活性是该类菌株的共性。通过对土壤杆菌K84菌株(与菌株K1026具有相同遗传背景)基因组序列比对，发现了与根瘤菌结瘤相关的nod类基因。王丽等[10]研究了土壤杆菌C58/pGV3850菌株的固氮生理特性，结果表明该菌具有自生固氮活性，这与本文研究结果一致。

已报道的溶磷微生物主要有细菌、真菌和放线菌[11-12]。本文首次定性、定量检测了土壤杆菌的溶磷活性，发现26株待测菌株中有19株在Pikovskaya固体培养基上生长并可产生明显的溶磷圈，并且首次验证了生防菌株K1026的溶磷活性。作者通过检索发现菌株K84基因组中含有多个磷酸酶基因，推测土壤杆菌可产生胞外酶促进磷酸钙的转化。

在促进黄瓜幼苗生长方面，本文研究发现土壤杆菌K1026浸种处理，对黄瓜根长和根部干重都有显著增加； Hao等[13]检测了一株土壤杆菌D3对油菜种子根系生长的影响，结果表明土壤杆菌D3可显著增强油菜种子根系的生长，并测定了该土壤杆菌的转氨酶活性，验证了转氨酶活性高低与根系生长的长度呈现正相关。说明生防菌株K1026不仅可用于樱桃等核果类果树根癌病的生物防治，还可用于微生物肥料的生产起到促进植物生长的作用。

本文研究发现K1026生防菌株对小麦的根部生长没有明显的促进作用，推测是由于土壤杆菌在自然条件下可以趋化性地感染大多数双子叶植物，而对小麦等单子叶植物不易侵染造成的，具体原因还需要进一步的研究。

[1]CLARE B G, KERR A, JONES D A. Characteristics of the nopaline catabolic plasmid inAgrobacteriumstrains K84 and K1026 used for biological control of crown gall disease [J].Plasmid, 1990, 23(2): 126-137.

[2]KERR A. Biological control of crown gall [J]. Australasian Plant Pathology, 2016, 45: 15-18.

[5]李纪顺，陈凯，杨合同，等.伯克霍尔德氏菌B418 的生物学特性[C]//中国植物病理学会2004年学术年会论文集. 北京:中国农业科学技术出版社, 2004:432-437.

[6]PIKOVSKAYA R I. Mobilization of phosphorus in soil in connection with vital activity of some microbial species[J]. Microbiologiya, 1948, 17:362-370.

[7]LI J F, ZHANG S Q, SHI S L, et al. Mutational approach for N2-fixing and P-solubilizing mutant strains ofKlebsiellapneumoniaeRSN19 by microwave mutagenesis[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2011,27(6): 1481-1489.

[9]LASSALLE F, CAMPILLO T, VIAL L, et al. Genomic species are ecological species as revealed by comparative genomics inAgrobacteriumtumefaciens[J]. Genome Biology and Evolution, 2011,3: 762-781.

[10]王丽，张静娟.土壤杆菌固氮生理特性研究[J].微生物学报,1994,34(5):385-392.

[11]林英，司春灿，韩文华，等.解磷微生物研究进展[J]. 江西农业学报，2017,29( 2)：99-103.

[13]HAO Y, CHARLES T C, GLICK B R. ACC deaminase activity in avirulentAgrobacteriumtumefaciensD3[J].Can J Microbiol, 2011, 57(4), 278-286.

Nitrogen fixation, phosphate solubilizing activity and plant growth promotion ofAgrobacterium

WEI Yan-li1, Maarten RYDER2, LI Ji-shun1, LI Ling1, YANG Yu-zhong1, YANG He-tong1,3*

(1. Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences, Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Jinan 250014, China; 2. School of Agriculture, Food and Wine, University of Adelaide, Adelaide 5064, Australia; 3.Research Center of Sustainable Development in the Yellow River Delta，Dongying 257000, China)

∶Through selective medium, the function of fixing nitrogen and dissolving phosphorus of 26Agrobacteriumstrains were studied by both qualitative and quantitative analysis methods. Meanwhile, growth-promoting effect of Australian bio-control strain K1026 on cucumber and wheat was measured by pot experiment. The results showed that all the strains regardless of pathogenicity or non-pathogenicity could grow normally on nitrogen-free medium. 19 of the 26 strains had the ability to dissolve phosphorus, the Phosphate released by K1026 in Pikovskaya broth medium was up to 109.11 μg/mL , having the strongest activities among all stains. The pot experiments showed that K1026 had obvious growth-promoting effect on the cucumber seedlings, and the root length and the dry weight of the root biomass was increased by 25.49%, 62.96%, respectively, compared with the control. However, K1026 had no obvious effect on the growth-promotion of wheat.

∶Agrobacteriumtumefaciens;AgrobacteriumrhizogenesK1026; nitrogen fixation; phosphate-solubilisation; growth promotion effect

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.005

2017-05-11

山东省重点研发计划(2016GNC113010)；2017年度山东省引进国外智力成果示范推广项目；黄河三角洲学者工程专项

魏艳丽(1978—)，女，高级工程师，研究方向为农业微生物。E-mail: yanli_wei@163.com

*通信作者，杨合同，研究员，黄河三角洲学者特聘专家，研究方向为农业病害生物防治。E-mail: yanght@sdas.org

S436.629

A

1002-4026(2017)04-0026-05