基因敲除弱化产1,3-丙二醇Klebsiellapneumoniae荚膜多糖的合成

刘情，王小婉，诸葛斌，陆信曜，宗红，方慧英，宋健

（1江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室工业微生物研究中心，江苏 无锡 214122；3江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122）

基因敲除弱化产1,3-丙二醇Klebsiellapneumoniae荚膜多糖的合成

刘情1，2，王小婉2，诸葛斌1，2，陆信曜1，2，宗红1，2，方慧英1，2，宋健3

（1江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室工业微生物研究中心，江苏 无锡 214122；3江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122）

1,3-丙二醇（1,3-PDO）是重要的平台化合物，在高性能纤维合成等领域具有广泛应用。Klebsiellapneumoniae是优良的1,3-PDO生物合成细胞工厂，但该菌代谢甘油合成1,3-PDO时积累大量荚膜多糖，影响底物与产物的高效转运，导致发酵液黏度增大，限制发酵法生产1,3-丙二醇的下游提取及产业化。本研究基于已报道的K.pneumoniae荚膜合成途径，利用Red重组技术对K.pneumoniae荚膜多糖合成途径中的起始糖基转移酶wecA基因及参与荚膜多糖后期组装的跨膜蛋白wzi基因进行敲除，并考察上述基因缺失对菌株荚膜含量、细胞形态、菌体生长、发酵液黏度及产物合成的影响。研究发现，同时缺失wecA和wzi基因对于弱化荚膜多糖效果显著，荚膜含量降低38.5%，细胞基本丧失菌毛合成及相互粘连能力，1,3-PDO产量提高23.0%，为菌株改造提供了一种新思路。

荚膜多糖；敲除；Klebsiellapneumoniae；1,3-丙二醇

1,3-丙二醇（1,3-propanediol，简称1,3-PDO）是一种重要的平台化合物，在纺织等领域具有广泛的应用[1]。在已有的1,3-PDO合成菌株中，Klebsiella pneumoniae具有高产量及高转化率等优点，是目前研究的热点。但K.pneumoniae在发酵过程中产生大量荚膜多糖，使得发酵液黏度变大、下游分离提取困难[2]，限制了发酵法生产1,3-PDO的工业化。

荚膜多糖是黏附于细菌表面，由重复的单糖连接成的同聚体或异聚体[3]。与大肠杆菌I型荚膜多糖的合成途径相似，K.pneumoniae荚膜多糖的合成途径为Wzy依赖聚合途径。在此途径中，各种糖基转移酶催化活性单糖按一定顺序连接形成低聚重复单元，随后通过内膜，在周质空间进一步聚合，最后在Wzi蛋白作用下形成成熟的荚膜多糖[4-6]。基于上述途径，研究者通过敲除uge、wzabc等基因显著降低荚膜多糖合成能力[7-8]，表明敲除荚膜合成相关基因能够有效降低荚膜多糖含量。但目前对于弱化荚膜多糖合成与细胞形态、菌株发酵性能间的关系等的系统研究较少。

基于此，本文通过敲除K.pneumoniae中参与荚膜前期合成的关键基因wecA[9-10]和负责将荚膜结构连接到细胞表面的wzi基因[11]，考察这两个基因缺失对K.pneumoniae甘油代谢过程中荚膜合成、细胞形态和与发酵性能的关系。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

K.pneumoniaeZG25由本实验室保存；蛋白胨、酵母提取物购自Oxiod公司；氯霉素（Cm）和卡那霉素（Kan）购自上海生工生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶购自大连宝生物有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA marker购自上海捷瑞生物工程有限公司；色谱柱Aminex HPX-87H column （300mm×7.8mm×9μm）购自BioRad公司；TEM-H2TACH2H-7650购自日立高新技术公司；PCR仪、电转仪购自Eppendorf公司；引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成；1,3-PDO标准品购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 引物

本文实验中所使用的引物见表1。

表1 本文使用的引物

1.3 方法

1.3.1 培养基与培养方法

种子培养基：酵母粉5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L。

发酵培养基：甘油40.0g/L，葡萄糖 2.0g/L，酵母粉6.0g/L，KH2PO47.5g/L，MgSO42.0g/L，(NH4)2SO42.0g/L，FeSO40.005g/L，VB120.015g/L，微量元素溶液0.1mL/L，KOH调pH至8.5。

微量元素溶液：ZnCl20.07g/100mL，MnCl2·4H2O 0.1g/100mL，H3BO30.06g/100mL，CoCl2·6H2O 0.2g/100mL，CuCl20.02g/100mL，NiCl2·6H2O 0.025g/100mL，Na2MoO4·2H2O 0.035g/100mL。

种子培养：1%接种量（体积比），37℃，150r/min，培养8～10h。发酵培养：250mL三角瓶50mL装液量，4%接种量（体积比），pH 8.5。37℃、150r/min振荡培养10h后，将转速调节为100r/min。所有培养基在1×105Pa灭菌30min。

1.3.2 缺失菌株的构建

利用Red同源重组敲除系统构建各缺失菌株：以pKD13质粒为模板，设计引物构建出需敲除基因的同源打靶片段。然后将所克隆出的打靶片段电转入K.pneumoniae（含氯霉素抗性的pKD46质粒）感受态中，并涂kan抗性平板筛选出阳性菌。随后42℃、150r/min消除阳性菌株中的pKD46质粒，电转入pCP20质粒，进行菌株kan标记的剔除。并通过菌落PCR筛选出阳性菌株，最后42℃、150r/min培养消除质粒pCP20，获得不带抗性的缺失菌。

1.3.3 分析测定方法

菌株荚膜多糖提取与含量测定方法参照文献[12]。菌株形态通过透射电子显微镜观察。生物量的测定通过测定发酵液在600nm处的光吸收值。代谢产物的测定使用高效液相色谱法，色谱柱为Aminex HPX-87H柱，柱温60℃；流动相为5mmol/L H2SO4，流速为0.6mL/min，进样量为10μL。使用示差折光及紫外检测器，外标定量法定量[13]。

2 结果与分析

2.1K. pneumoniaeΔwecA、K. pneumoniaeΔwzi及K. pneumoniaeΔwecAΔwzi菌株的构建

利用Red重组系统，分别构建wecA、wzi基因单独缺失及双基因缺失重组K.pneumoniae。如图1所示，野生菌中wecA和wzi基因大小分别约为1600bp和1400bp。而缺失菌中两个基因的PCR产物理论大小分别约为650bp和180bp。挑取PCR验证正确的转化子，并消除其所带抗性和质粒，分别获得缺失菌K.pneumoniaeΔwecA、K.pneumoniaeΔwzi及K.pneumoniaeΔwecAΔwzi。

图1wecA基因和wzi基因敲除的PCR验证

2.2 基因缺失对荚膜多糖含量、细胞形态及发酵液黏度的影响

由于K.pneumoniae荚膜多糖一般是酸性多糖且含重复葡糖醛酸，可通过测定培养液中葡糖醛酸含量以定量分析细胞荚膜多糖[14-15]。在K.pneumoniae中，wecA基因编码的起始糖基转移酶将Und-PP（磷酸脂质载体）和活性单糖通过磷酸二酯键连接形成Und-P-P-GlcNAc，进而启动荚膜多糖前期单体的合成。然而，由表2可知K.pneumoniaeΔwecA培养液中葡糖醛酸含量与野生菌相比仅降低6.8%，表明wecA对荚膜多糖合成的影响较弱。有研究表明，K.pneumoniae中可能存在WecA的同工酶（如WbaP）[16]。因此，虽然wecA在荚膜多糖合成前期具有重要作用，但潜在的同工酶能够代偿其功能，使得敲除wecA无法有效阻断荚膜多糖的合成。而膜蛋白Wzi的功能是将前期合成的荚膜结构连接到细胞表面，进而在细胞表面形成成熟的荚膜多糖。敲除该基因后，K.pneumoniaeΔwzi培养液中葡糖醛酸含量降低20.6%，表明敲除wzi基因对荚膜合成具有显著影响。双缺失菌株K.pneumoniaeΔwecAΔwzi荚膜多糖含量降低38.5%，表明多位点阻断能够进一步弱化细胞荚膜多糖的合成。

表2 基因缺失对葡糖醛酸含量的影响

为进一步明确基因缺失对细胞荚膜合成和形态的影响，对荚膜合成弱化作用最明显的K.pneumoniaeΔwecAΔwzi和野生菌进行透射电镜观察比较。如图2(a)和图2(d)，野生菌胞外可见明显的半透明状荚膜，同时其外周还黏附了多糖等较多颗粒状物质。而双缺失菌K.pneumoniaeΔwecAΔwzi细胞外半透明状荚膜显著减少，同时未见黏附颗粒物。有文献报道，荚膜多糖减少可能会影响菌毛的合成[8]。与此相似，由图2(b)和图2(e)对比发现，K.pneumoniaeΔwecAΔwzi菌株细胞周围菌毛几乎没有。此外，有研究表明细胞间黏结程度主要受荚膜多糖含量影响，荚膜减少会减弱黏结效应[17]。如图2(c)，野生菌较为紧密地相互黏结，而K.pneumoniaeΔwecAΔwzi则可见清晰的单细胞分散菌体[图2(f)]，表明敲除菌细胞间的相互黏结能力基本丧失。上述结果进一步证实，敲除wecA和wzi后胞外荚膜含量显著降低，同时菌毛合成弱化及细胞黏附能力减弱。

表3 各菌株发酵液低速离心后上清液的吸光值

有研究表明，荚膜多糖含量能够影响发酵液黏度[2]。为考察基因缺失对发酵液黏度影响，将不同菌株在相同条件下培养，取同等菌体量后在3000r/min下离心6min，测定各样品上清液在600nm处的吸光值，以表征不同发酵液黏度间的差异。如表3所示，相对野生菌株，K.pneumoniaeΔwecAΔwzi与K.pneumoniaeΔwzi上清液的OD600值分别减少27.3%和15.9%，表明基因缺失后发酵液黏度降低、细胞更易离心沉淀。由上述结果可知，菌株荚膜多糖越少时，发酵液的黏度越小，能够减少搅拌能耗、提高发酵液过滤效率，便于下游产品的分离提取。

2.3 基因缺失对生物量和甘油代谢的影响

细胞组分（如荚膜多糖、脂多糖和菌毛）与细胞完整性和生长能力具有一定关联性。如图3(a)，与野生菌相比，K.pneumoniaeΔwzi生物量基本保持不变，K.pneumoniaeΔwecA生物量提高了28.7%，而双基因缺失菌株生物量提高了15.8%。上述结果表明，wzi基因对细胞生物量无影响，而缺失wecA基因则有利于细胞生长。有学者研究表明，弱化细胞脂多糖合成可能有利于菌株的生长，但弱化菌株荚膜多糖合成对于菌株生长的影响则因基因而异[18-19]。与wzi相比，wecA基因除参与荚膜合成外，还在脂多糖合成途径前期具有重要作用[9-10]。因此，敲除wecA可能通过影响脂多糖合成，进而提高细胞生物量。

基因敲除对细胞甘油代谢的影响如图3所示。其中，各缺失菌株的甘油消耗速率均有所提高。K.pneumoniaeΔwecA、K.pneumoniaeΔwzi及K.pneumoniaeΔwecAΔwzi的1,3-PDO产量分别提高了4.0%、17.4%和23.0%。荚膜合成基因敲除弱化了荚膜多糖的合成，可能使得更多的碳流被引导到中心碳通路[2]，从而强化主代谢产物的合成和生物量积累。另一方面，荚膜合成相关基因虽与产物代谢途径无直接关联，但菌株荚膜多糖减少可以改变膜通透性[17]，有利于底物和产物的转运，加快底物甘油的消耗和产物合成。此外，碳流和还原力向1,3-PDO及生物量合成偏转，不利于主要副产物2,3-丁二醇（2,3-butanediol，简称2,3-BDO）的积累，从而使得缺失菌2,3-BDO产量都略有降低。而其他副产物量较少，碳流偏转对其影响微弱，使得积累量基本不变（数据未列出）。结合表2及图3(c)，可知K.pneumoniaeΔwecA、K.pneumoniaeΔwzi及K.pneumoniaeΔwecAΔwzi荚膜多糖合成能力越弱则更有利于1,3-PDO的积累。因此，推测菌株荚膜多糖合成越少、膜通透性越高、发酵液黏度越低，更有利于1,3-PDO的合成和转运。

图3K.pneumoniae及基因敲除突变株发酵甘油产1,3-PDO的生物量、甘油、1,3-PDO和2,3-BDO的浓度

3 结论

通过对K.pneumoniae荚膜多糖合成途径中的wecA及wzi基因进行敲除，考察了荚膜含量、细胞形态及发酵性能的变化。结果表明，基因敲除能够有效降低荚膜含量、提高1,3-PDO产量。其中，双缺失wecA及wzi基因后，细胞外周荚膜多糖及菌毛量减少，且细胞间黏附能力减弱，荚膜多糖含量降低了38.5%，1,3-PDO产量提高了23.0%，与已有报道相比，本研究的组合敲除策略能够更有效地提高1,3-PDO产量。综上可知，敲除荚膜合成途径相关基因能够有效降低荚膜含量，降低发酵液黏度、搅拌能耗和过滤效率，提高细胞膜通透性、促进1,3-PDO的合成，为菌株改造实现1,3-PDO产业化合成提供了一种新思路。

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Reducing the capsular polysaccharide synthesis ofKlebsiella pneumoniaein 1,3-propanediol fermentation by genes knocking-out

LIU Qing1，2，WANG Xiaowan2，ZHUGE Bin1，2，LU Xinyao1，2，ZONG Hong1，2，FANG Huiying1，2，SONG Jian3
（1Carbohydrate Chemistry and Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China；2The KeyLaboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Research Centre of Industrial Microbiology，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China；3School of Chemistry and Material，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

1,3-propanediol （1,3-PDO）is an important platform compound and has been widely used in the production of high performance fiber synthesis.Klebsiella pneumoniaeis an excellent 1,3-PDO biosynthetic cell factory. However，the capsular polysaccharide accumulation ofK. pneumoniaeincreased the viscosity of fermentation broth and impacted the efficient transport of substrate and product，resulting in an obstacle in downstream extraction and industrialization of 1,3-PDO. In this study，by analyzing the capsular synthesis pathway ofK. pneumoniae，the key geneswecA（initial glycosyltransferase gene） andwziinvolved in the assembly of capsular polysaccharide were disrupted by Red recombinant system. The effects of genes deletion on capsule content，cell morphology，cellgrowth，broth fluid viscosity，and product synthesis，were studied. The capsular content was reduced by 38.5%，which led to the loss of cells fimbriae synthesis ability and the adhesion，and the titer of 1,3-PDO increased by 23.0%. The study provided a novel prospect on the development ofK.pneumoniaeon the production of 1,3-PDO.

capsular polysaccharide；knocking-out；Klebsiellapneumoniae；1,3-propanediol

Q78

：A

：1000-6613（2017）09-3447-06

10.16085/j.issn.1000-6613.2017-0081

2017-01-13；修改稿日期：2017-02-08。

高等学校学科创新引智计划（111-2-06）和江苏省青年自然科学基金（BK20140134）项目。

刘情（1991—），女，硕士研究生，研究方向为发酵工程。E-mail: qingliu19@163.com。联系人：诸葛斌，博士，教授。E-mail：bzhuge@ 163.com。