血管性痴呆模型小鼠海马神经元的电生理改变

韩 瑞 仇福成 李培培 王文婷 顾 平

(河北医科大学第一医院神经内科，河北 石家庄 051000)

血管性痴呆模型小鼠海马神经元的电生理改变

韩 瑞 仇福成 李培培1王文婷 顾 平

(河北医科大学第一医院神经内科，河北 石家庄 051000)

目的观察血管性痴呆(VD)发病过程中神经元的电生理改变。方法应用被动逃避反应实验、神经元硫堇染色技术、膜片钳操作技术，对实验动物的认知功能及动物海马CA1区神经元结构和密度进行评价，进而观察神经元的兴奋性。结果与假手术组小鼠相比，模型组小鼠被动逃避反应实验成绩明显下降，海马CA1区神经元密度未见明显改变，而海马神经元的兴奋性出现了显著降低。结论神经元电兴奋性的降低可能是导致VD的主要机制之一。

血管性痴呆；被动逃避反应实验；动作电位

血管性痴呆(VD)是因脑组织血液循环障碍所致的一种获得性、进行性认知功能障碍综合征〔1〕。神经元的信息传递是编码为动作电位的形式进行的，如果神经元受到损伤，动作电位的形成变慢，信息的加工过程出现异常，进而影响神经元的功能〔2〕。海马是学习记忆的关键中枢，也是缺血后最易受损的脑区之一〔3,4〕。本实验观察VD小鼠海马神经元的电生理改变。

1 材料与方法

1.1动物模型和分组 将40只9月龄雄性C57小鼠随机分为：①假手术组：只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流。②模型组：分别暴露双侧颈总动脉，反复夹闭双侧颈总动脉3次，每次夹闭20 min，每次间隔10 min。

1.2避暗箱实验 术后第22天，开始对所有动物进行避暗箱测试，采用被电次数和避暗潜伏期作为学习记忆的检测指标。实验的第1天进行适应性训练：暗箱不通电，将小鼠以背向暗箱的方向放入透明箱中，令其可自由进出暗箱，适应5 min，记录小鼠第1次进入暗箱的时间为潜伏期。实验的第2天进行认知训练：暗箱通电，将小鼠以背向暗箱的方向放入透明箱中，训练5 min，记录小鼠进入暗箱被电次数。实验第3天进行记忆检测：暗箱通电，将小鼠以背向暗箱的方向放入透明箱中，记录小鼠第1次进入暗箱的时间即避暗潜伏期，如果在5 min内小鼠不进入暗箱，则避暗潜伏期记为300 s。

1.3脑组织病理学评价 动物在行为学测定结束后，断头取脑，冠状切取视交叉后1～4 mm脑组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，常规脑组织切片(5 μm)，硫堇染色观察海马组织学改变。高倍镜下计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片海马各计数3个区段取平均数为神经元密度(ND)。

1.4电流钳记录 动物在行为学测定结束后，将小鼠冰上快速断头取脑(1 min左右)，冠状切去部分额部、枕部，枕部切面用瞬间黏合剂粘固到振动切片机的平台上。浸入冰水汇合氧饱和的人工脑脊液，在冠状平面上切取5～6片皮层脑组织(300 μm厚度)。置于95%O2+5%CO2饱和的人工脑脊液孵育槽中，室温下(21℃～26℃)孵育1 h备用。数据由MultiClamp 700B放大器采集，应用全细胞电流钳记录模式，观察了海马CA1区神经元动作电位的频率。

1.5统计学方法 应用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1避暗箱实验结果 与假手术组〔(22.9±0.3)s〕比较，在被动逃避反应实验第1天训练阶段的潜伏期在模型组无明显变化〔(24.1±13.8)s，P>0.05〕。在避暗箱实验第2天学习阶段，被电次数在模型组较假手术组显著增多〔(2.7±1.2) vs (1.8±0.8)s,P<0.05〕。在实验第3天，与假手术组小鼠相比，被动逃避潜伏期在模型组显著缩短〔(174.2±105.3)vs (251.4±84.4)s，P<0.05〕。

2.2小鼠海马CA1区病理学结果 假手术组和模型组小鼠海马CA1区锥体细胞3～5层，排列整齐致密，细胞形态完整，胞核饱满，核仁清晰，均无明显细胞缺失，见图1。与假手术组(257.7±15.3)相比，模型组小鼠海马CA1区ND有降低趋势，但结果无统计学差异(252.2±13.0，P>0.05)。

图1 两组海马CA1区病理学结果(HE，×400)

2.3神经元兴奋性变化 与假手术组(23.3±3.3)相比，模型组小鼠海马CA1区的神经元动作电位产生个数(18.3±4.3)显著减少(P<0.05)，见图2。

图2 两组海马CA1区神经元动作电位示意图

3 讨 论

本文VD动物模型未观察到神经元结构明显损伤，与国内其他的VD模型中所描述的不同〔5〕。文献报道神经元兴奋性的降低可以引起认知功能损伤〔6〕，本研究中也印证了这一电生理现象在VD中的作用。文献报道改善神经元兴奋性可以提高个体的认知功能〔7,8〕，这就为临床治疗VD提供了新的思路，开发、寻找可以提高神经元兴奋性的药物或物理治疗方法，提高神经元的兴奋性；并以此为靶点为寻找改善VD认知功能障碍的方法提供理论支持。调节神经元兴奋性的离子通道主要有钾离子通道，L型钙离子通道〔8,9〕，具体是何种离子通道特性的改变引起的神经元兴奋性变化，针对这些神经元兴奋性变化的离子通道机制还需要进一步研究。

1Roh JH,Lee JH.Recent updates on subcortical ischemic vascular dementia〔J〕.J Stroke,2014;16:18-26.

2Randall AD,Booth C,Brown JT.Age-related changes to Na+channel gating contribute to modified intrinsic neuronal excitability〔J〕.Neurobiol Aging,2012;33:2715-20.

3Lee CH,Yoo KY,Choi JH,etal.Neuronal damage is much delayed and microgliosis is more severe in the aged hippocampus induced by transient cerebral ischemia compared to the adult hippocampus〔J〕.J Neurol Sci,2010;294:1-6.

4Fjell AM,McEvoy L,Holland D,etal.What is normal in normal aging? Effects of aging,amyloid and Alzheimer′s disease on the cerebral cortex and the hippocampus〔J〕.Prog Neurobiol,2014;117C:20-40.

5Choi DH,Lee KH,Kim JH,etal.NADPH oxidase 1,a novel molecular source of ROS in hippocampal neuronal death in vascular dementia〔J〕.Antioxid Redox Signal,2013;21(4):533-50.

6McKay BM,Matthews EA,Oliveira FA,etal.Intrinsic neuronal excitability is reversibly altered by a single experience in fear conditioning〔J〕.J Neurophysiol,2009;102(5):2763-70.

7Xiao Z,Cilz NI,Kurada L,etal.Activation of neurotensin receptor 1 facilitates neuronal excitability and spatial learning and memory in the entorhinal cortex:beneficial actions in an Alzheimer′s disease model〔J〕.J Neuroscience,2014;34(20):7027-42.

8Rose GM,Ong VS,Woodruff-Pak DS.Efficacy of MEM 1003,a novel calcium channel blocker,in delay and trace eyeblink conditioning in older rabbits〔J〕.Neurobiol Aging,2007;28(5):766-73.

9Thibault O,Landfield PW.Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging〔J〕.Science,1996;272(5264):1017-20.

〔2016-04-17修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

顾 平(1970-)，女，博士，主任医师，博士生导师，主要从事老年神经系统退行性疾病研究。

韩 瑞(1977-)，女，主治医师，主要从事老年变性疾病研究。

R741.044

A

1005-9202(2017)17-4211-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.019

1 河北省古城县医院内科