HPLC法同时测定黄草乌中滇乌碱和草乌甲素的含量

徐怡+秦波+曹红云+张晓南+刘慧+游燕

摘要：目的建立同时测定黄草乌中滇乌碱和草乌甲素含量的高效液相色谱方法。方法采用Waters XTerra MS C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相为0.025mol/L磷酸二氢钾溶液（1000ml加1ml磷酸）-乙腈：四氢呋喃（25：15）为流动相梯度洗脱，流速1 ml/min，柱温 30℃；检测波长260nm。结果滇乌碱和草乌甲素分别在5.27～421.6μg/ml、5.02～401.6μg/ml范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为99.7%～104.3%、96.8%～99.3%，RSD分别为1.34%、0.82%。结论经方法学验证，本法可用于同时测定黄草乌中滇乌碱、草乌甲素的含量，为该药材的质量控制和临床用药安全提供了有力的分析手段。

关键词：黄草乌；滇乌碱；草乌甲素；高效液相色谱法

中图分类号：R927.2文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）09-0070-03

黄草乌Aconitum vilmorr-ianum Kom.毛茛科植物的块根。主要含有滇乌碱、草乌甲素，二者均具有镇痛抗炎药理活性，滇乌碱的毒性最强，草乌甲素次之。因此本试验采用高效液相色谱法同时测定黄草乌中的2种主要二萜类生物碱的含量，为黄草乌药材的质量控制和临床用药安全提供参考，也为进一步合理开发草乌甲素原料植物资源提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器及试剂美国Agilent1100高效液相色谱仪（四元泵、DAD检测器、自动进样器、在线真空脱气机、智能化柱温箱及Agilent化学工作站）；N-1001型旋转蒸发仪；TC-6 KA型电子天平；DFY-500型粉碎机；SK-3200LH型超声清洗仪（功率250W，频率59KH）；乙腈（色谱纯，默克公司）、四氢呋喃（色谱纯，默克公司）；其余为分析纯；水为自制超纯水。

1.2试药黄草乌药材购自昆明菊花园中药材市场，其产地为昭通，经云南省药物所究所天然药物资源研究中心正高级工程师高丽鉴定经鉴定系毛茛科植物黄草乌Aconitum vilmorrianum Kom.的干燥块根。草乌甲素对照品（中国食品药品生物检定所，纯度≥98%），滇乌碱为本实验室自制，经纯度测定，其纯度为98.1%。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱Waters XTerra MS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液（每1000 mL加磷酸1ml）为流动相A，乙腈：四氢呋喃（25：15）为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速1 mL/min；柱温30℃；检测波长：260 nm；进样量10 μL。见表1。

2.2对照品溶液制备取滇乌碱对照品和草乌甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含100μg的混合溶液，即得。见图1。

2.3供试品溶液制备精密称取黄草乌药材（过三号筛）约5 g，置具塞锥形瓶中，加5%盐酸5 mL，精密加入甲醇-异丙醇（1：1）50 mL，称定重量，密塞，超声处理（功率250W，频率59KH）30 min，放冷，再称量，用甲醇-异丙醇（1：1）补足减失的量，摇匀，滤过，滤液用氨水调节至中性。精密量取续滤液25 mL，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣用甲醇定容至5 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4线性关系考察精密量取混合对照品贮备液（滇乌碱：421.6 μg/mL、草乌甲素：401.6 μg/mL），分别用甲醇稀释成滇乌碱：421.6、210.8、105.4、84.32、42.16、21.08、10.54、5.27 μg/mL，草乌甲素：401.6、200.8、100.4、80.32、40.16、20.08、10.04、5.02 ug/mL的对照品溶液，照确定的色谱条件进样测定，记录峰面积，以含量及相应峰面积得线性方程和相关系数。见表2，图2～3。

线性方程：Y=1603.5X+0.5324，r=0.9999，滇乌碱在5.27～421.6 μg/ml浓度范围内线性关系良好。

线性方程：Y=1608.7X+7.7093，r=0.9999，草乌甲素在5.02～401.6 μg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.5精密度考察取同一混合对照品溶液（滇乌碱105.45 μg/mL、草乌甲素100.35 μg/mL），按“2.1”项色谱条件连续进样6次，峰面积RSD分别为1.32%、0.92%，表明仪器精密度良好。

2.6 穩定性试验 取已制备好的供试品溶液按“2.1”项色谱条件，分别于0、6、8、12、24 h进样，进样体积10μl，以峰面积计算，结果RSD=1.2%（n=5），所得的样品中滇乌碱、草乌甲素含量基本一致，说明样品在24h内稳定。

2.7重复性试验精密称取黄草乌药材6份，按照“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，测定滇乌碱和草乌甲素含量，测得滇乌碱和草乌甲素平均含量分别为187.13 μg/g，58.76 μg/g，RSD分别为0.98%、1.23%，表明本方法重复性良好。

2.8回收率试验取已知含量的黄草乌药材（滇乌碱：187.13 μg/g和草乌甲素：58.76 μg/g）9份，每份2.5 g，精密称定，以1：0.5，1：1，1：1.5分别精密加入对照品，按“2.3”项供试品溶液制备方法制备，测定滇乌碱和草乌甲素含量，计算回收率，回收率分别为99.7%～104.3%、96.8%～99.3%；RSD分别为1.34%、0.82%。表明该方法准确度较好。

2.9耐用性试验

2.9.1不同色谱柱考察选用不同品牌的3根色谱柱：Waters XTerra MS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），WatersSymmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Shiseido MGⅡC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）（日本 资生堂），对供试品溶液和标准品溶液按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果3根色谱柱保留时间与峰形略有差异，但滇乌碱和草乌甲素的峰都能完全分离，分离度均达到1.5以上，且所测得的滇乌碱和草乌甲素含量只是略有差异。表明色谱柱型号对检测结果影响不大。endprint

2.9.2柱温变化考察改变柱温，其他条件不变，按“2.1”项下色谱条件进样测定供试品溶液，记录色谱图，结果表明柱温在20℃～40℃变动时，测定结果影响不大。

2.9.3不同色譜仪考察选用不同品牌的3台高效液相色谱仪：Agilent 1100，Waters 2695，Shimadzu LC 2010，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果表明在仪器的品牌、型号有变动时，对照品的峰能够完全分离，且进样浓度有小的波动时，测定结果影响不大，在仪器稳定的情况下，仍可以准确进行定量测定。

2.10样品测定取不同批次的样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，记录各成分的峰面积，以外标法计算样品中各成分的含量。见表4。

3讨论

试验中的黄草乌中均含有滇乌碱。部分不含草乌甲素，可能与药材的产地和生长年限相关。二者均为二萜类生物碱，由于这类成分本身具有较强的药理活性和毒性，因此，对其精确地控制尤为重要。本研究不仅为黄草乌的质量标准研究奠定基础，也为精确控制云南产草乌类药材的安全性和有效性提供依据。

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