聚多巴胺修饰棉花固定金属离子用于磷酸化多肽的富集

王 倩, 何小梅, 冯钰锜

(生物医学分析化学教育部重点实验室,武汉大学化学与分子科学学院,湖北武汉 430072)

翻译后修饰是蛋白质在翻译后通过共价键的作用，将某些功能基团通过化学修饰的方式结合到底物蛋白质上。蛋白质翻译后修饰是将前体蛋白质功能化，进而发挥正常生物学功能的重要步骤，它几乎参与了细胞所有的生命活动过程，在生物体内具有举足轻重的作用[1]。可逆的蛋白质磷酸化修饰作为生物体内较为重要的翻译后修饰，参与调控细胞增殖、分化以及信号传递等生命活动。磷酸化的异常是导致细胞癌变的关键步骤之一，往往会引起众多疾病，这使得对磷酸化蛋白质的研究具有重要的意义[2 - 3]。

目前，鉴于质谱(MS)高灵敏度和高精确度等优势，已成为分析磷酸化蛋白质的有力工具[4]。然而，磷酸化多肽在进行MS分析时，离子化效率低、受非磷酸化多肽信号的抑制以及蛋白质和脂质等基质的干扰，导致其检测灵敏度低。因此，在MS检测前降低基质干扰，对目标多肽的分离富集是十分必要的[5]。磷酸化多肽的预富集方法主要包括固定金属亲和色谱法 (IMAC)[6 - 8]、金属氧化物亲和色谱法(MOAC)[9 - 10]、离子交换色谱法(包括SAX 和 SCX)[11 - 12]、免疫亲和富集法和化学衍生法等[13 - 15]。其中，IMAC由于其纯化效率高、简单易行、价格低廉等优点而成为磷酸化多肽富集最常用的方法之一。

纤维素作为最丰富的天然聚合物材料，环境友好、廉价、生物相容性好而且孔隙度高。棉花作为一种纤维素材料，近年来得到极大的关注。并且棉花的表面含有大量的羟基，可用于材料功能化修饰。根据之前的文献报道，棉花作为一种纤维材料，能被装填在注射器针头或者移液枪吸头中作为微型化的固相萃取(SPE)装置，实现对目标分析物快速、简单的分离富集。在之前的工作中，多种与棉花相关的功能化材料被开发，并用于复杂生物样品中目标分析物的选择性富集，均表现出很好的效果[7]。然而之前的修饰方法可能存在制备方法繁琐等问题。聚多巴胺(PDA)是贝壳等生物粘性蛋白分泌物的主要成分，具有极强的粘附性，优良的亲水性和生物相容性。其单体多巴胺(DA)在弱碱性条件下很容易发生聚合反应，得到PDA，可以附着在几乎所有材料的表面，并且材料表面所沉积的亲水性的PDA膜即使在超声震荡的情况下也能保持良好的粘附性[16 - 17]。因此，本文通过在天然的棉花纤维表面修饰PDA，然后利用儿茶酚羟基固定Ti4+，制备了一种IMAC材料Cotton@PDA-Ti4+并将其用于磷酸化多肽的富集。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

多巴胺购自阿拉丁化学试剂(上海)有限公司。Ti(SO4)2、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、乙醇(EtOH)和氨水(25%)购自上海国药集团化学试剂有限公司。色谱纯乙腈(ACN)购自美国 Fisher Scientific 公司。三氟乙酸(TFA)、H3PO4、 2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)、牛血清白蛋白(BSA)和β-酪蛋白(β-casein)等购自美国Sigma-Aldrich 公司。胰蛋白酶(Trypsin)从美国 Worthington Biochemical 公司购买。纯水来自于 Milli-Q 装置。

棉花(Cotton)及脱脂牛奶购于当地超市。健康人血清来源于武汉大学校医院，放置-8 ℃冰箱中备用。

1.2 Cotton@PDA-Ti4+的制备及表征

PDA的修饰参照文献方法[18]：称取200 mg棉花，将其浸入到35 mL 10 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.5)中，然后加入DA，使其终浓度为2 mg/mL，将离心管放入摇床，室温下振荡10 h。最后得到褐色的PDA修饰的棉花(Cotton@PDA)，用水和乙醇清洗，50 ℃真空干燥，备用。将干燥好的Cotton@PDA放入50 mL的离心管内，加入35 mL Ti(SO4)2(100 mmol/L)，将离心管放入摇床，室温下振荡2 h。得到Ti4+修饰的棉花(Cotton@PDA-Ti4+)，用水和乙醇清洗，50 ℃真空干燥。

钛元素的表征采用日本Shimadzu公司的EDX-720型能量色散X-射线光谱仪，其中仪器使用的激发源为Mg Kα射线。

1.3 实验方法

1.3.1多肽样品的制备将β-酪蛋白用溶液I(Tris-HCl，100 mmol/L,pH=8.5)配制成1 mg/mL蛋白溶液，按胰蛋白酶∶β-酪蛋白为1∶50(m/m) 加入胰蛋白酶，于37 ℃水浴锅中酶解16 h。所得酶解产物旋干后，存放于-8 ℃冰箱。

将1 mg BSA 溶于100 μL变性缓冲溶液(8 mol/L尿素，100 mmol/L Tris-HCl，pH=8.5)。加入TCEP(100 mmol/L，5 μL)，室温下反应 20 min。然后加入碘乙酰胺(IAA)(100 mmol/L，10 μL)，于室温避光反应30 min。最后加入300 μL 溶液I，按胰蛋白酶∶β-酪蛋白为 1∶50(m/m) 加入胰蛋白酶， 于37 ℃水浴锅中酶解16 h。所得酶解产物旋干后，存放于-8 ℃冰箱。

脱脂牛奶酶解物：将100 μL脱脂牛奶用真空离心浓缩仪旋干后，用100 μL变性缓冲液复溶牛奶。加入TCEP(100 mmol/L，5 μL)，室温下反应 20 min。然后加入IAA(100 mmol/L，10 μL)，于室温避光反应30 min。最后加入300 μL溶液I，按胰蛋白酶∶β-酪蛋白为 1∶50(m/m) 加入胰蛋白酶， 于37 ℃水浴锅中酶解16 h。所得酶解产物旋干后，存放于-8 ℃冰箱。

从武汉大学校医院收集健康人血样，通过标准临床处理步骤制得人血清样品。将血清样品保存在-2 ℃冰箱中，在用于富集磷酸化多肽时，血清(2 μL)需要用上样液稀释50倍。

1.3.2磷酸化多肽的富集过程称取5 mg Cotton@PDA-Ti4+，装填在200 μL移液枪枪头中，并用一根比较钝的针头将 Cotton@PDA-Ti4+固定在吸头较前端的位置，将长度控制在大约4 mm 左右。将枪头装在移液枪上，通过推-吸液体，完成分离富集实验。

上样液和解吸液分别为100 μL 0.1%TFA-50%ACN(V/V)和2.5%氨水溶液，加入多肽样品后通过反复推吸来完成分离富集实验。上样前利用移液枪吸/推20次50 μL的0.1%TFA-50%ACN(V/V)实现对材料的活化；活化后吸/推40次上样液，使磷酸化多肽被充分吸附在材料上。然后用50 μL 0.1%TFA-50%ACN(V/V)清洗两次，之后用50 μL 2.5%氨水溶液解吸两次，两次各推拉30次，然后将解吸液合并，用真空离心浓缩仪旋干。最后用1.2 μL 基质溶液(含20 mg/mL 2,5-DHB的50%ACN,1%H3PO4)溶解多肽，全部样品用于基质辅助激光解吸-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析。

对于标准蛋白β-酪蛋白酶解物，上样量为3 pmol；对于血清样品上样量为2 μL；对于脱脂牛奶酶解物，1 mL复溶后，取1 μL上样。

1.3.2质谱分析所有的质谱分析都采用日本Shimadzu公司的Axima TOF2型MALDI-TOF2MS仪。MALDI-MS分析时采用波长为337 nm的氮气激光器，其脉冲宽度为3 ns；采用20 kV的加速电压，在正离子反射模式下进行检测。扫描范围(m/z)1 000～3 500 Da，每张谱图是200次激光扫描的平均结果。

2 结果与讨论

2.1 Cotton@PDA-Ti4+的合成及表征

Cotton@PDA-Ti4+作为一种新的IMAC材料，其制备条件温和，所需反应时间较短。在碱性条件下，DA单体通过聚合反应在Cotton表面形成PDA膜，得到Cotton@PDA。Ti4+通过与儿茶酚羟基之间的配位作用，被固定到Cotton@PDA上，得到最终产物Cotton@PDA-Ti4+。并且Cotton作为基底，使得反应过程中的分离、清洗等操作步骤变得简单快速。结果判定(图1)：经PDA修饰后，Cotton由本来的白色变为褐色，说明PDA成功地粘附在Cotton的表面。EDX谱图(图2)显示，Cotton@PDA-Ti4+的主要元素组成为C、N和Ti。其中，Ti元素的质量分数为2.0%。以上数据表面，该方法可以有效地将PDA修饰到Cotton表面，并且儿茶酚羟基也可以有效地固定Ti4+。

图1 棉花在PDA修饰前(a)后(b)的数码照片Fig.1 The digital photo of cotton before modification with PDA(a) and after modification with PDA(b)

图2 Cotton@PDA-Ti4+的能量色散X-射线(EDX)光谱图Fig.2 EDX spectrum of Cotton@PDA-Ti4+

图3 β -酪蛋白酶解液直接分析(a)，经Cotton@PDA-Ti4+富集后解吸液(b)及萃余液(c)的质谱图Fig.3 MALDI-MS of tryptic digest of β -casein obtained by direct analysis(a),the elution(b) and eluate(c) after enrichment using Cotton@PDA-Ti4+

2.2 Cotton@PDA-Ti4+富集磷酸化多肽的性能

2.2.1Cotton@PDA-Ti4+富集的选择性实验首先将Cotton@PDA-Ti4+用于富集标准蛋白(β-casein)酶解物中的磷酸化多肽。当酶解物直接用MALDI-TOF MS 分析时，质荷比m/z1 500附近多为非磷酸化多肽，仅可以看到m/z2 061.8和m/z3 122.1两个磷酸化多肽的信号，非磷酸化多肽的干扰较为严重，并且所能检测到的磷酸化多肽的峰很弱(图3(a))。经过 Cotton@PDA-Ti4+富集后，我们可以检测到6个磷酸化多肽的信号峰，其中，所能检测到的磷酸化多肽的信息如表1所示。质荷比为m/z1 500附近的非磷酸化多肽基本消失不见，表明它们并没有被Cotton@PDA-Ti4+非特异性吸附(图3(b))。而且在萃余液中，没有看到磷酸化多肽的信号峰(图3(c))。以上结果表明Cotton@PDA-Ti4+对磷酸化多肽具有很好的选择性。

表1 β -casein酶解物富集之后得到的磷酸化多肽信息

a:The phosphorylation sites are marked "-".

为了考察 Cotton@PDA-Ti4+在较多非磷酸化多肽的干扰下对标准磷酸化多肽的富集效果，分别选取了三个比例的多肽混合液作为考察标准。选取的蛋白酶解物分别是β-酪蛋白和BSA，其比例分别为1∶100、1∶500和1∶1 000。多肽混合液直接用MALDI-TOF MS检测时，谱图中基本都是非磷酸化多肽的信号峰(图4(a)、(c)和(e))，表明非磷酸化多肽的存在确实会抑制磷酸化多肽的质谱检测，并且比例越高，抑制作用越强，导致在质谱图中基本看不到磷酸化多肽的信号。因此，进一步证明，在磷酸化多肽进行MS检测之间，对其进行有效地分离富集是必不可少的。经过Cotton@PDA-Ti4+富集后(图4(b)、(d)和(f))，我们分别可以看到3个质谱信号较强的磷酸化多肽峰，与富集前相比，大大降低了非磷酸化多肽信号的干扰。以上实验结果表明，Cotton@PDA-Ti4+可以非常有效地从高比例非磷酸化多肽的体系中高选择性地分离磷酸化多肽。

图4 β -酪蛋白和BSA酶解混合液直接分析(a，c，e)和经过Cotton@PDA-Ti4+富集(b，d，f)的质谱图Fig.4 MALDI-MS of the tryptic digest mixtures of β -casein and BSA without(a,c,e) and with(b,d,f) Cotton@PDA-Ti4+ enrichmentMolar ratios of β -casein to BSA are 1∶100(a and b),1∶500(c and d),and 1∶1 000(e and f) after enrichment using Cotton@PDA-Ti4+.

2.2.2Cotton@PDA-Ti4+富集方法效率的考察通过降低β-酪蛋白酶解物用量考察Cotton@PDA-Ti4+的富集效率。随着β-酪蛋白的用量从100 fmol降低到 10 fmol，我们从图5(a)和5(b)中分别检测到3和1个磷酸化多肽的信号。实验结果表明，Cotton@PDA-Ti4+可用于较低(10 fmol)的样品中分离磷酸化多肽，说明该方法具有较高的富集效率。

2.3 Cotton@PDA-Ti4+对实际样品中磷酸化多肽的富集

2.3.1Cotton@PDA-Ti4+富集人血清中磷酸化多肽人体血清作为一种基质较为复杂的样品，不仅含大量蛋白质，还有大量的盐和数万个内源性多肽。其中，内源性磷酸化多肽与人类疾病的发生发展紧密相关。然而，复杂的基质效应使得样品在用质谱直接分析时，盐和其他多肽蛋白质干扰严重，甚至看不到多肽的信号峰。即使通过稀释，降低基质干扰也很难观察到多肽的信号(图6(a))，而经过材料富集后，可以清晰看到 4 个磷酸化多肽的质谱峰(图6(b)),其序列信息见表2。上述结果表明，Cotton@PDA-Ti4+可以有效地从复杂的生物样品中成功地分离富集磷酸化多肽。

图5 不同量β -酪蛋白经Cotton@PDA-Ti4+富集后的质谱图Fig.5 MALDI-MS of tryptic digest of β -casein with different amounts(100 and 10 fmol) obtained after enrichment with Cotton@PDA-Ti4+ 100 fmol(a);10 fmol(b).

图6 血清样品直接分析(a)和经过Cotton@PDA-Ti4+富集后(b)的质谱图Fig.6 Mass spectra of human serum phosphopeptides obtained by direct analysis(a) and after enrichment with Cotton@PDA-Ti4+(b)

表2 人血清富集之后得到的磷酸化多肽信息

"-":The same as table 1.

图7 脱脂牛奶裂解液直接分析(a)和经Cotton@PDA-Ti4+富集后(b)的质谱图Fig.7 MS of tryptic digest of nonfat milk phosphopeptides obtained by direct analysis(a) and after enrichment with Cotton@PDA-Ti4+(b)

2.3.2Cotton@PDA-Ti4+富集脱脂牛奶裂解液中磷酸化多肽脱脂牛奶中除了α-酪蛋白醇和β-酪蛋白醇两种磷酸化蛋白外，还有大量非磷酸化蛋白质。当酶解产物直接经质谱分析时，虽然可以检测到 7 个磷酸化多肽的信号峰，但是谱图中大多数是非磷酸化多肽的信号峰，并且所能看到的磷酸化多肽的信号很弱(图7a)。然而经过 Cotton@PDA-Ti4+富集后，在解吸液谱图中可以清楚的看到脱脂牛奶中15个磷酸化多肽的信号峰；并且除这些峰外几乎没有其他杂质峰的干扰(图7b)。其中，所能检测到的磷酸化多肽的信息如表3 所示。以上实验结果表明 Cotton@PDA-Ti4+可以从复杂的牛奶样品中高选择性的分离富集磷酸化多肽。

表3 脱脂牛奶裂解液富集之后得到的磷酸化多肽信息

"-":The same as table 1.

3 结论

本实验利用PDA修饰棉花来固定金属离子，合成了一种固定金属亲和色谱材料Cotton@PDA-Ti4+，并将其用于磷酸化多肽的富集。该材料机械性能好，化学性能稳定和生物相容性好，且制备过程简单，通过简易的In-pipet-tip SPE装置使整个富集操作过程简便快速。实验结果表明，Cotton@PDA-Ti4+不仅可以从简单的蛋白酶解物(β-酪蛋白酶)中富集到大量磷酸化多肽，并且在含有大量非磷酸化多肽的复杂样品中对磷酸化多肽也表现出良好的选择性。另外，利用Cotton@PDA-Ti4+对磷酸化多肽富集的方法也有较高的富集效率。将Cotton@PDA-Ti4+富集方法应用于实际样品，如人类血清以及脱脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集，说明该方法有可能用于磷酸化蛋白质组的全分析。