大体积样品堆积-毛细管电泳-紫外检测分析鼠肝中不同亚型金属硫蛋白

周小清， 戴玉洁， 黄林芳， 何 蔓， 陈贝贝， 胡 斌

(武汉大学化学与分子科学学院，教育部生物医学分析化学重点实验室，湖北武汉 430072)

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸、低分子量(约6～7 kDa)的蛋白，广泛存在于细菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物体内[1]。目前发现的MT有MT-1、MT-2、MT-3和MT-4四种主要构型，其中MT-1/2是分布最广泛的两种构型，在多种类型细胞内以及不同组织如肾脏、肝脏等都有较高的表达。目前MT的定量主要有间接检测和直接检测[2]，包括电化学方法、免疫分析法、色谱/质谱法等。电化学检测MT主要是基于-SH 的电化学活性[3]。Vojtech Adam等[4]将吸附转移剥离技术(AdTS)与计时电位滴定分析方法(CPSA)相结合用于分析富含-SH的生物活性物质如半胱氨酸、氧化/还原谷胱甘肽、植物螯合肽以及MT等。免疫学方法常被用于病理学研究获取MT在组织中的分布信息，主要包括采用酶标记的酶联免疫吸附测定法(ELISA)[6 - 7]和采用同位素标记的放射免疫法(RIA)[7]。但是传统免疫方法的准确度和灵敏度皆易受到较高的背景干扰。Butcher等[8]采用镧系元素标记，时间分辨免疫荧光分析定量MT，检测延时的荧光信号，可以避免短暂存在的背景干扰，大大提高了方法的灵敏度和准确度。

质谱/光谱法相结合是研究MT常用的手段。 Rachel等[9]采用十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶电泳结合光谱分析，及高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)对暴露在Cu2+、Zn2+、Pb2+等重金属离子的鱼胆汁中的MT进行分析，二者结果一致，且经过重金属暴露，胆汁中的MT含量与肝脏中MT具有相同的升高趋势。Arai等[10]建立了HPLC-ICP-MS法分析Ag+和AgNPs对巨噬细胞和鼠肺的毒性的方法，体外研究结果显示Ag+可以更有效被鼠肺吸收并且进入系统循环，从而对老鼠巨噬细胞的毒性更强；而AgNPs则慢慢进入胞内，产生较温和的刺激。Christian等[11]采用高效液相色谱-电感耦合等离子体原子发射光谱(HPLC-ICP-AES)方法对人肝脏中的金属在MT中的分布进行了研究。Balbina等[12]采用毛细管电泳结合电喷雾电离-飞行时间质谱(ESI-TOF MS)对兔肝中的MT亚型进行分析，结果表明，MT-1和MT-2分别包含三种不同的亚型，并且在MT-1和MT-2中皆含有痕量的无N-乙酰化基团的构型，同时采用基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)验证，给出了相似的结果。

聚丙烯酰胺涂层可以封闭毛细管内壁上的Si-OH，有效减小电渗流，如果控制涂层的厚度适中，-NH2官能团甚至可以使电渗流反向，大大提高MT的分离度[17 - 19]。另外，由于常规紫外检测器灵敏度较低，通常需要采用在柱富集技术用于MT的富集。lvarez-Llamas等采用毛细管电泳-紫外检测法(CE-UV)，分别通过常规堆积[15]和极性转换大体积样品堆积[20]富集MT-1和MT-2，但是后者通过极性转换排出基质，堆积效率更高，若采用ICP-MS作为检测器，可以将MT-1和MT-2的检出限降至ppb级[21]。本文目的是制备聚丙烯酰胺涂层毛细管用于分离MT-1和MT-2，建立大体积样品堆积-毛细管电泳-紫外检测法(LVSS -CE-UV)分离分析MT，并用于鼠肝中MT的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与检测条件

MT-1，MT-2的分离检测采用的Aglient G1600A毛细管电泳仪(California,CA,USA)，柱温20 ℃，分离毛细管为33.5 cm(25 cm)×75 μm i.d.× 360 μm o.d.的聚丙烯酰胺涂层毛细管(河北永年光纤)。条件优化和分析性能评价采用检测波长为226 nm，实际鼠肝样品分析时选取的检测波长为200 nm。标准进样模式为：5 kPa，5 s；LVSS模式下：5 kPa，40 s。新制备的涂层毛细管用缓冲溶液冲洗10 min后即可使用。两次电泳分离之间用缓冲溶液冲洗4 min即可。本工作中所用缓冲溶液为75 mmol·L-1Hepes-Tris(pH=7.4)，配制方法为75 mmol·L-1Hepes和75 mmol·L-1Tris溶液以体积比2∶1混合而成。

1.2 标准物质和试剂

MT-1、MT-2购于大连保税区联合博泰生物技术有限公司，分别溶于超纯水中配制成1 mg·mL-1的标准溶液。丙烯酰胺单体、N,N-四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)皆为生物纯；γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(WD-70)为分析纯，购于武大有机硅技术有限公司。

1.3 聚丙烯酰胺涂层毛细管制备

聚丙烯酰胺涂层毛细管的合成主要参考文献方法[19]，分为三步：活化反应、硅烷化反应和聚合反应。经活化后的毛细管内壁Si-O打开形成Si-OH；Si-OH与WD-70反应引入末端烯键；随后以APS作为引发剂，TEMED为催化剂条件下，丙烯酰胺在已引入的烯键表面发生聚合反应，得到聚丙烯酰胺涂层。图1和表1分别为聚丙烯酰胺涂层毛细管的反应机理示意图和具体操作过程。

图1 涂层毛细管的反应机理示意图Fig.1 The reaction mechanism of the coating process

1.4 大体积样品堆积(LVSS)

本工作采用非极性LVSS对MT-1、MT-2进行在柱富集。由于聚丙烯酰胺涂层使得电渗流(EOF)速率降低，小于MT的电泳速度，即在压力进样模式下大体积进样一段样品后，施加反向电压，基质在EOF作用下向进口端移动并排出，MT则在电泳速度和EOF的合速度下向检测窗口迁移并分离。由于基质(水)电导较低，所以整个电泳过程中，电流从小到大变化，当基质完全排出管外时，堆积完成，电流趋于稳定。

表1 聚丙烯酰胺涂层毛细管的制作过程

1.5 鼠肝样品处理

1.5.1肝脏样品准备9只sprague dawley大鼠(300～320 g)分别被分为控制组、Cd2+诱导实验组和Zn2+诱导实验组。分别腹腔注射5 mL·kg-1生理盐水(用作控制组)，25 mg·kg-1Zn2+(ZnAc2溶液,以Zn2+计算)以及2.5 mg·kg-1Cd2+(CdCl2溶液,以Cd2+计算)，每天注射一次,连续注射2 d，两次注射间隔24 h，最后一次注射完成后24 h取肝。将新鲜肝脏用生理盐水清洗去除表面血渍和体液后，置于-20 ℃冰箱内，储存待用。

1.5.2金属硫蛋白的提取取2 g肝脏和2 mL 10 mmol·L-1Hepes-Tris缓冲溶液(pH=7.4)，共同置于研钵中研磨成浆，将所有浆液转入离心管内，置于摇床上震动20 min后,离心(5 000 r·min-1,5 min)取上清液，所得上清液在60 ℃加热15 min，迅速冷冻降温后再离心(5 000 r·min-1,5 min)取上清液，所得上清液经90 ℃加热2 min后进行超速离心(105 000 g×1 h,4 ℃)，最后取上清液用于下一步实验。

1.5.3排阻色谱(SEC) 采用岛津LC-10A液相色谱仪，使用Superdex×200 SEC柱用于粗分金属硫蛋白，Agilent 7500 ICP-MS同时监测Cd111和Zn66的信号值，获取MT的出峰时间，便于截取MT馏分。流动相为20 mmol·L-1NH4Ac溶液，流速为0.7 mL·min-1,进样体积为40 μL，连续进样3次，将3次所截取馏分(约21 mL)合并，冻干，用50 μL超纯水重溶，经0.2 μm滤膜过滤后，用于后续CE分析。

2 结果与讨论

2.1 聚丙烯酰胺涂层毛细管制备

图2 聚丙烯酰胺涂层毛细管分离MT-1和MT-2的电泳图Fig.2 Electropherograms of MT-1 and MT-2 in polyacrylamine coated capillaryBuffer:100 mmol·L-1 Hepes-Tris(pH=7.4);Separation voltage:-26 kV;Analytes:50 μg·mL-1;Injection:5 kPa for 10 s;Detection:226 nm.

将所制备的聚丙烯酰胺涂层毛细管用于MT-1和MT-2混合标准溶液分离。由图2可以看到，该涂层毛细管对MT-1/2分离性能良好，并且两次电泳之间经过缓冲溶液简单的冲洗，即可获得较好的分离重现性。

随后对聚丙烯酰胺涂层进行了扫描电镜(SEM)表征，如图3所示，与未经涂覆的毛细管相比，经聚丙烯酰胺涂覆后的毛细管内壁均匀附着着涂层。将该涂层毛细管保存在缓冲溶液中有利于延长其使用寿命，该涂层毛细管可以重复使用25～30次。

图3 裸毛细管(A)和聚丙烯酰胺涂层毛细管(B)内壁的扫描电镜(SEM)图Fig.3 SEM images of uncoated capillary(A) and polyacrylamine coated capillary(B)

图4 常规(A)及LVSS(B)进样方式下缓冲溶液浓度对MT-1和MT-2分离的影响Fig.4 Effect of buffer concentration on separation of MT-1 and MT-2 in normal mode(A) and in LVSS mode(B)

2.2 LVSS条件优化

2.2.1离子强度在常规进样模式下(5 kPa,10 s)，以及LVSS模式下，分别考察了Hepes-Tris缓冲溶液浓度在50～125 mmol·L-1之间对分离MT-1和MT-2的影响。结果表明，在所考察的范围内，离子强度对分离效率并无影响，见图4。实验选择Hepes-Tris缓冲溶液的浓度为75 mmol·L-1。

2.2.2LVSS进样时间进样时间是影响LVSS的堆积效率的主要因素，进样时间越长，意味着进入毛细管的目标分析物含量越大，堆积效率越高；但是进样时间也受缓冲容量，以及目标分析物自身电迁移特性影响，在涂层毛细管中还会受涂层厚度约束。为了在确保分离效率的前提下尽量延长进样时间以获取最大堆积效率，考察了进样时间在5～55 s范围内对LVSS效率的影响，结果如图5所示。可以看到，随着进样时间延长，出峰时间延长，目标分析物信号值也逐渐增强。综合考虑分离时间和堆积效率，最终LVSS的进样时间定为40 s。

综上所述，最优LVSS条件为：以75 mmol·L-1Hepes-Tris作为缓冲溶液，LVSS堆积模式为：5 kPa 40 s，分离电压为-26 kV，检测波长为226 nm。

2.3 LVSS -CE-UV的分析性能

在最优的LVSS条件下，对LVSS -CE-UV分析MT-1/2的分析性能进行了评价，结果列于表2。本方法对MT-1/2的检出限分别为0.80、1.01 μg·mL-1，定量限为3 μg·mL-1，在3～500 μg·mL-1之间具有良好的线性关系。聚丙烯酰胺涂层毛细管制备重现性良好，批内相对标准偏差(RSD)分别为7.9%、3.2%，批间RSD分别为7.6%、9.4%，富集倍数分别为13、11倍。图6是浓度为25 μg·mL-1的MT-1/2混合标准在常规进样(5 kPa，5 s)和经过LVSS堆积后的色谱图，说明经LVSS堆积后，CE-UV检测MT-1和MT-2的灵敏度得到了大大的提高。

表2 LVSS -CE-UV方法对MT-1/2的分析性能

aRSD:MT-1/2,5 μg·mL-1;bSI:5 kPa for 5 s;cEF:EF=LODs of CE-UV/LODs of LVSS -CE-UV.

将本方法的部分分析性能与文献中采用CE分析金属硫蛋白的工作相比，检出限不及采用ICP-MS作为检测器的工作[21 - 22]；与没有涂层，同样采用UV检测的方法相比，本工作与文献[15 - 16,23]所给的检出限在同一个数量级，不及文献[20]的检出限，但是无聚丙烯酰胺涂层的毛细管对MT-1和MT-2的分离度较低，实际样品分析时杂峰较多，定性困难。

表3 用于MT-1/2分析的基于CE的方法分析性能比较

NMS:normal mode stacking;PAA:polyacrylamide.

2.4 SEC-ICP-MS分离

将1.5.2所得到的含MT的溶液采用SEC进一步分离，通过ICP-MS监测Zn66和Cd111的信号来确定MT的出峰时间，并截取馏分。SEC-ICP-MS色谱图如图7所示。结果表明在1 200～1 800 s内均监测到了强烈的Zn66和Cd111信号。后续实验中截取1 200～1 800 s 内的SEC馏分，用于后续冻干分析。

图6 常规(a)和LVSS(b)进样方式下MT-1/2的电泳分离图Fig.6 Electrophoretograms of MT-1/2 in normal mode(a) and LVSS mode(b)

图7 由SEC-ICP-MS得到的胞液色谱图Fig.7 Chromatograms of cytosol obtained by SEC-ICP-MS

2.5 LVSS -CE-UV分析鼠肝样品

在优化的LVSS条件下，对最终处理好的样品进行定量分析，图8分别是Zn2+诱导组、Cd2+诱导组和控制组(生理盐水)实际样品的电泳图。结果表明，不同实验组即使经过相同的样品处理过程，其基线仍表现不同，可能原因是不同诱导方式对肝脏的影响(除了MT含量变化)存在差异。不过Zn2+诱导组和Cd2+诱导组均检测出了一定含量的MT-1/2；而由于鼠肝内自然存在的MT-1/2含量较低，且生理盐水不具备诱导作用，因而控制组未检测到MT-1/2。采用标准加入法进行定量，即以最终所获得的样品溶液为基质，加入不同浓度的MT-1/2的混合标准溶液进行考察，结果如表4所示。通过计算得出Zn2+诱导组的最终样品内的MT-1和MT-2分别为4.6和3.5 μg·mL-1，经换算后可得Zn2+诱导组的鼠肝中MT-1和MT-2分别为31.9和24.3 μg·g-1(湿重含量)；而Cd2+诱导组的最终样品内的MT-1和MT-2分别为2.3和4.5 μg·mL-1，其鼠肝中MT-1和MT-2分别为15.9和31.2 μg·g-1(湿重含量)。需要指出的是，鼠肝中的MT-1/2的湿重含量是以“MT的提取效率为100%”为假设前提进行计算的。

表4 标准加入法结果(峰面积)

图8 经Zn2+(A)、Cd2+(B)和生理盐水(C)诱导的鼠肝中MT-1/2的LVSS -CE-UV电泳图Fig.8 Electropherograms obtained by LVSS -CE-UV for MT-1/2 in rat liver samples induced by Zn2+(A),Cd2+(B),and physiological saline(C)

3 结论

本工作在聚丙烯酰胺涂层毛细管内实现了无极性转换LVSS分离富集MT-1/2，自制的聚丙烯酰胺涂层可以有效抑制毛细管管壁对MT-1/2的吸附，大大提高了分离度和重现性，涂层均匀稳定，可以重复使用25～30次。相比于常规区带电泳，结合LVSS可将MT-1/2的检出灵敏度提高一个数量级。该方法不仅具有低成本、操作简单的优点，而且对肝脏样品进行适当处理和排阻色谱分离后，可以对鼠肝中的MT-1/2直接进行定量分析，拓展了CE-UV在分析检测复杂样品中MT方面的应用。