急性动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血CD137的表达特点及其临床意义

方丽波 何洋 敖东慧 钟珊珊 刘广志

急性动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血CD137的表达特点及其临床意义

方丽波 何洋 敖东慧 钟珊珊 刘广志

目的探讨急性动脉粥样硬化性脑梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)患者外周血肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor super family，TNFRSF)成员CD137的表达特点及其临床意义。方法入选发病72 h以内住院患者共46例，其中ACI组27例，无症状性颈动脉狭窄(asymptomatic carotid stenosis，ACS)组19例，另选择同期健康体检者20名为正常对照组(normal control，NC)。采用流式细胞术和流式细胞磁珠微阵列法(CBA)检测各组观察对象外周血CD4+T细胞及其CD4+CD28-T细胞亚群表面CD137的表达和血浆可溶性CD137水平。结果ACI 组外周血CD4+CD28-T细胞比例〔(14.13±4.42)%〕、CD4+CD28-T细胞CD137的表达〔(2.60±2.14)%〕、血浆sCD137〔(3.43±2.48)pg/mL〕水平显著高于ACS组〔(9.03±4.60)%、(0.70±0.66)%、(2.07±0.814)pg/mL〕和NC组〔(8.08±3.30)%、(0.45±0.31)%、(1.26±0.70)pg/mL〕(P<0.01)，且ACI组CD4+T细胞的CD137表达及血浆sCD137水平与NIHSS 评分(P<0.05)和梗死体积(P<0.01)呈正相关。结论ACI患者发病早期CD4+CD28-T细胞、CD4+T细胞及其CD4+CD28-T细胞表面CD137、血浆sCD137水平升高，且CD4+T细胞的CD137表达及血浆sCD137水平与NIHSS评分呈正相关，提示其可能作为评估脑梗死临床严重程度的外周生物学标志。

动脉粥样硬化性；脑梗塞；抗原，CD137； CD4+CD28-T细胞

颅内外动脉粥样硬化已被证实是脑梗死发病的重要病因。目前研究认为，动脉粥样硬化是一种炎性疾病[1-2]，T细胞在其发病过程中的作用较为重要[3-4]。近年来研究结果显示，CD137〔induced by lymphocyte activation(ILA)，4-1BB〕在人类动脉粥样硬化斑块中高表达[5-6]，急性脑梗死(ACI)患者发病48 h外周血CD4+CD28-T细胞比例升高，单核细胞CD137L表达和血浆sCD137L水平亦显著升高，且与脑卒中严重程度相关[7]。目前有关CD137在急性动脉粥样硬化性脑梗死中的作用机制尚不清楚。该研究通过分析ACI患者外周血CD4+CD28-细胞比例、细胞表面CD137表达和血浆sCD137水平的变化，旨在为今后开展脑梗死的治疗、疾病的诊断和预后提供客观依据。

1 对象和方法

1.1对象收集2014-01—2016-03北京大学人民医院神经内科住院的患者46例，发病在72 h以内，其中：(1)ACI患者27例，男17例，女10例，年龄47～84岁，平均(65.6±11.8)岁。ACI患者符合全国第四次脑血管病会议诊断标准，均符合TOAST分型标准中的大动脉粥样硬化亚型(LAA)卒中，根据其病史、临床表现、头颅CT/MRI及MRA 检查予以确诊。排除服用抗血小板类药物史或具有心源性脑栓塞危险因素(如房颤、急性心肌梗死和感染性心内膜炎等)者。(2)无症状性颈动脉狭窄(asymptomatic carotid stenosis，ACS)患者19例，男13例，女6例，年龄43～83岁，平均(69.0±9.8)岁。ACS患者经颈动脉超声/MRA/CTA检查示无症状ACS(狭窄率>50%)。排除服用抗血小板类药物史、有缺血性脑卒中病史或头颅MRI 检查明显异常者。另选取同期神经内科体检者20名作为健康对照组(NC)，男9名，女11名，年龄54～88岁，平均(71.4±10.6)岁。

所有参与者均签署知情同意书并经北京大学人民医院伦理委员会同意。以上参与者均排除自身免疫病、肝病、肾病或肿瘤者。

1.2主要材料和仪器聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液(比重1.077，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)，异硫氰酸(FITC)标记CD28、FITC标记IgG1购自Becton Dickinson公司，别藻蓝蛋白(APC)标记人CD137、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(Percp)标记CD4、APC标记IgG1购自R&D公司，2%台盼蓝，4%(质量浓度)多聚甲醛(PBS配制)，台式常温离心机(BAIYANG G20)，流式细胞仪(Becton Dickinson公司)，人4-1BB/TNFRSF9 CBA试剂盒(Aimplex公司)。

1.3方法

1.3.1基本资料采集：收集患者发病72 h内入院信息，采用美国国立卫生院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)对ACI组病情严重程度进行神经功能评分。ACI组的NIHSS评分为3～15分，平均(6.82±3.28)分。同时采用Centricity RIS/PACS 影像系统处理MRI图片，利用弥散加权像(diffusion-weighted imaging，DWI)测量并计算患者急性梗死灶体积。ACI组梗死病灶体积为3.25～55.44 cm3，中位数为6.25 cm3。

1.3.2外周血单个核细胞(PBMC)CD137及血浆sCD137检测：(1)采集患者发病72 h内肘静脉6 mL，肝素抗凝。低速离心(800 r/min，5 min，离心半径15 cm)获取血浆，通过CBA法测定血浆sCD137水平；经密度梯度离心法获得PBMC，采用流式细胞术检测CD4+、CD4+CD28-、CD4+CD28+T细胞CD137的表达率。(2)PBMC CD137表达：1)取肝素抗凝全血3 mL，用PBS倍比稀释。1∶1等体积缓慢加入淋巴细胞分离液后，移至离心管中，1500 r/min离心15 min(离心半径15 cm)。吸取分离液界面的白色细胞层。PBS冲洗1次，离心，弃上清，加入含2%(质量浓度)的台盼蓝计数细胞，将细胞悬液移至流式管。2)标记抗体：阴性对照管：CD4 Percp 8 μL，IgG1 FITC 8 μL，IgG1 APC 8 μL；试验管：CD4 Percp 8 μL，CD28 FITC 8 μL，CD137 APC 8 μL；混匀，4 ℃避光孵育20 min。PBS冲洗，离心。弃上清，300 μL 4%(质量浓度)多聚甲醛固定，4 ℃固定30 min，上机检测。(3)CBA法检测血浆sCD137表达：1)按照试剂盒说明书将标准品梯度稀释。2)加入人CD137微球45 μL/孔，加入待测样品和标准品45 μL/孔，封板，避光室温震荡60 min。配制1×Biotin Ab。3)清除孔内液体，加入washing buffer 100 μL/孔，洗板，加入1×Biotin Ab 25 μL/孔，封板，避光室温震荡30 min。清空孔内液体，加入washing buffer 100 μL/孔，洗板，加入1×SA-PE 25 μL/孔，封板，避光室温震荡20 min。清空孔内液体，加入washing buffer 100 μL/孔，洗板。转入流式管上机进行检测。4)制作标准曲线，并根据准曲线计算样本值。

1.4统计学处理应用软件GrapPad Prism 5.0 进行分析处理。正态分布的计量资料用均数±标准差表示；符合正态分布且方差齐的多组间均数比较采用one way-ANOVA检验，两两比较采用Student-Newman-Keuls检验；计数资料采用卡方检验；CD137细胞亚群、sCD137浓度及NIHSS评分的相关分析采用Pearson相关检验，与脑梗死体积的相关性分析采用Spearman相关检验。取α=0.05。

2 结果

2.1各组基本资料比较ACI组高血压病史和吸烟者比例均高于NC组(均P<0.05)，余临床特征间比较差异无统计学意义(表1)。

2.2各组外周血CD4+T细胞及其亚群CD137表达比较ACI组CD4+CD28-T细胞亚群比例以及CD4+T细胞和CD4+CD28-T细胞CD137的表达均高于ACS组和NC组(均P<0.01)，而CD4+CD28+T细胞CD137的表达与ACS组和NC组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。结果见表2。

2.3血浆sCD137水平比较ACI组、ACS 组和NC组血浆sCD137水平分别为(3.43±2.48)、(2.07±0.814)、(1.26±0.70)pg/mL，3组血浆sCD137水平比较差异有统计学意义(F>11.6，P<0.01)，ACI组血浆sCD137水平较ACS和NC组增高(P<0.01)，而ACS组和NC组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4相关性分析ACI组CD4+T细胞CD137的表达与NIHSS 评分(r=0.6893，P<0.01)、梗死体积(r=0.5287，P<0.01)呈正相关；ACI 组CD4+CD28-T细胞比例与NIHSS评分呈正相关(r=0.3986，P<0.05)；ACI 组血浆sCD137 水平与CD4+T 细胞CD137的表达呈正相关(r=0.7517，P<0.01)，ACI 组血浆sCD137水平与CD4+CD28-T细胞比例呈正相关(r=0.5732，P<0.01)；ACI 组血浆sCD137 水平与NIHSS 评分(r=0.4686，P<0.05)、梗死体积呈正相关(r=0.5250，P<0.01)。

3 讨论

进入动脉粥样硬化斑块内的T细胞在识别多种抗原〔如氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，OxLDL)、内源和外源性热休克蛋白〕后，分化为1型辅助性T细胞(type 1 helper T cell，Th1)。Th1分泌的细胞因子(cytokine，CK)发挥强烈的炎性应答作用，加速稳定斑块向易损斑块的转变，进而引起斑块破裂及血管事件的发生[3-4]。在针对CK的研究中，肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor super family，TNFRSF)亦被证实与动脉粥样硬化和脑梗死相关。近年来TNFRSF 成员之一CD137被报道在人类动脉粥样硬化斑块中高表达[5-6]。

CD4+CD28-T细胞是Hansen和Martin等首先发现的一组缺乏CD28分子表达的CD4+T细胞亚群，具有独特的免疫功能。Tuttolomondo等[5]

表1 各组临床资料比较

注：ACI：急性脑梗死，ACS：无症状性颈动脉狭窄，NC：健康对照组，表2同；与NC组比较，aP<0.05

表2 各组外周血CD4+T细胞及其亚群CD137的表达(±s，%)

注：与ACS组和NC比较，aP<0.01

研究发现，脑梗死发病48 h后外周血CD4+CD28-T细胞比例升高，且与脑卒中严重程度相关。本研究结果显示，ACI组发病72 h内外周血CD4+CD28-T细胞比例明显升高，且与NIHSS评分呈正相关，表明在脑梗死急性期，CD4+CD28-T细胞作为炎性细胞，参与了脑梗死急性期的炎性反应过程，且能在一定程度上反映患者临床严重程度。本组资料显示ACI组高血压病史和吸烟者比例明显高于正常对照组，提示高血压及吸烟均与ACI 有关。

本研究结果显示，ACI 组CD4+T细胞CD137的表达、血浆sCD137 水平与NIHSS评分、梗死体积呈正相关；ACI 组血浆sCD137 水平与CD4+T 细胞CD137的表达、CD4+CD28-T细胞比例呈正相关，提示在ACI发病早期，CD4+CD28-T细胞、细胞表面CD137、血浆sCD137水平升高，此时活化的CD4+T细胞CD137表达上调，与其配体相互作用后提供了用以维持T细胞激活的共刺激信号，进而上调炎性免疫应答，强烈的免疫应答可加重脑组织损害[5，8]。近年来，Dongming等报道急性冠脉综合征患者膜结合型CD137(membrane-bound CD137，mCD137)和sCD137均较正常对照升高[7，9]。本研究发现ACI患者血浆sCD137水平明显高于ACS组和NC组，且与CD4+T细胞和CD4+CD28-T细胞上CD137的表达呈正相关，结合既往研究中急性ACI 患者CD14+单核细胞上CD137L表达升高[8-9]，作者推测在ACI急性期，激活的T细胞膜表面高表达CD137，经过剪切后脱落为sCD137释放入周围循环内，通过与抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)上CD137L作用后激活单核/巨噬细胞，释放大量的炎性CK，产生强烈的免疫应答而加重组织损伤。

综上所述，在ACI早期，患者CD4+CD28-T细胞、CD4+T细胞及其CD4+CD28-T细胞表面CD137、血浆sCD137水平的升高，且其水平与NIHSS评分呈正相关，在一定程度上可作为评估脑梗死临床病情的外周生物学标志。由于该研究未对ACI患者的CD137表达进行动态观察，有关其确切致病机制尚需进一步研究证实。

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ThefeaturesofCD137expressioninperipheralbloodofpatientswithacuteatheroscleroticcerebralinfarctionanditsclinicalsignificance

FANGLibo，HEYang,AODonghui,ZHONGShanshan,LIUGuangzhi*.

*DepartmentofNeurology,PekingUniversityPeople’sHospital，Beijing100044,China

LIU Guangzhi, Email：guangzhi2002@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the features of tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF) member CD137 expression in peripheral blood of patients with acute atherosclerotic cerebral infarction (ACI) and explore its clinical significance.MethodsA total of 46 inpatients within 72 h after disease onset were collected and then divided into two groups: the ACI group (27 cases), the asymptomatic carotid stenosis group (ACS, 19 cases). The normal control(NC) group consisted of 20 healthy volunteers. Flow cytometry and cytometry beads assay (CBA) were respectively used to detect the CD137 expression on T cells and the plasma soluble CD137 levels in peripheral blood of the participants.ResultsWithin 72 h after onset,the ACI group had a significant increase of CD4+CD28-T cell counts[(14.13±4.42)%], a higher CD137 expression on CD4+CD28-T cells[(2.60±2.14)]% and an increased level of plasma sCD137[(3.43±2.48)pg/mL] compared with the ACS group [(9.03±4.60)%,(0.70±0.66)%,(2.07±0.814)pg/mL] and the normal controls[(8.08±3.30)%,(0.45±0.31)%,(1.26 ±0.70)pg/mL]. The CD137 expression on CD4+T cells and the level of plasma sCD137 were correlated with NIHSS scores and volume of cerebral infarction in the ACI group(P<0.05,P<0.01) .ConclusionsCD4+CD28-T cell counts, the expression of CD137 on CD4+T cells and CD4+CD28-T cells and the plasma sCD137 levels were significantly elevated in the early phase of ACI. The CD137 expression on CD4+T cells and the level of plasma sCD137 were correlated with NIHSS scores in early phase of ACI.It indicates that they could be used as valuable peripheral biomarkers of stroke for evaluation of clinical disease severity to some extents.

plaque atherosclerotic; brain infarction;antigens CD137; CD4+CD28-T cell

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.05.006

国家自然科学基金资助项目(编号81441040)

100038 首都医科大学附属复兴医院神经内科(方丽波)；100044 北京大学人民医院神经内科(何洋、敖东慧、钟珊珊、刘广志)

刘广志，Email: guangzhi2002@hotmail.com

R743.3

A

1006-2963(2017)05-0335-04

2017-03-24)

(本文编辑：时秋宽)