一种蜗牛提取物对花粉破壁方法的研究

许意 孙明港 杨世玉 陈云飞 陈紫珺 陶伟

（安徽农业大学林学与园林学院，合肥230036）

一种蜗牛提取物对花粉破壁方法的研究

许意 孙明港 杨世玉 陈云飞 陈紫珺 陶伟

（安徽农业大学林学与园林学院，合肥230036）

成果背景：花粉里含有丰富的营养成分，被称之“植物微型营养库”，但因花粉壁的特殊结构，物理、化学及生物三类七种方法均难以进行破壁，影响了开发利用，即使加温至300℃，也难以使花粉释放出营养成分。方法：本项目受蜗牛于下雨天活动并对植物叶子进行蚕食的启发，捕捉蜗牛经超低温（-45℃）冷冻粉碎，加磷酸盐（pH 6.5,0.05 mol）缓冲液提取，离心去沉淀物，取清液，调pH至5.6后，沸水保温至浑浊即流水冷却至常温再离心，放冰箱存放待用；取厨房所收集废蛋壳加1%NaCl溶液提取，依前述提取蜗牛提取物方法制蛋壳蛋清提取物，放冰箱保存;取沉淀物与前沉淀物作饲料。花粉用1∶1之比例加生理盐水浸提温润后，分别加入前者两个动物提取物破壁，杀菌搅拌，完成破壁灭菌。结果：反应30分钟后显微镜和电镜观察表明，破壁率为97%以上，外表呈明显孔洞或裂沟，紫外分析表明260 nm、280 nm波长吸收值均比破壁前提高30%以上；镜检反应液含菌数<10个（以大肠杆菌数计，每ml数）反应系统混合物进行固液分离，用于食品加工或制作保健品。

花粉破壁；蜗牛提取物；蛋壳蛋清提取物；瞬时沸水变性处理；固液离心分离

花粉（pollen）含有丰富的营养物质，对人体具有较好的增强免疫力和耐力、抗疲劳，在临床医疗上是治疗前列腺炎的一剂良药，因而被人们称作植物类的“微型营养库”，能提供生命的活力。它的粉壁上包含着由胡萝卜素和类胡萝卜素酯的氧化聚合物（即花粉素）能抗酸、碱、盐及酶学水解，结构稳定，妨碍了人们对它的内含物在食品和医药上的开发应用。为了有效地提取花粉内的目标产物，目前国内外对花粉破壁研究出物理类（机械磨碎、渗透压差、变温、超声波、气流）、化学类（有机溶剂脱壁）、生物类（微生物发酵、蜂粮温育）等七种破壁方法[3,4]，取得了一定成果。本项目研究者还曾获得国家发明奖[3,4]。但是因花粉来自不同植物，花粉壁结构差异较大，多种破壁方法对不同花粉的外壁的破壁效果均存在较大差异，一般均在50%左右。欲达到较好破壁效果，需要二种以上的方法组合。不仅耗能大，且存在二次污染。因此花粉加工的产业化始终难以形成。本项目研究者采取下雨天气从草丛、蔬菜叶子上采集蜗牛，经-45℃低温冰冻捣碎后再用生理盐水快速匀浆提取蜗牛躯体内液，于4000 r/min离心取清液放冰箱待用;然后加入润湿的花粉浆中，搅拌5～10分钟破壁，显微镜观察并测定破壁效果，蜗牛浆液及蛋壳的提取物的沉淀经干燥作为家禽饲料。

1 材料方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料：蜗牛采集于草丛；花粉购自养蜂场；蜗牛破壁成分的提取媒介：生理盐水;

1.1.2 主要器械：工业离心机；紫外分析仪；搅拌器（日本）；水浴锅；板框过滤机（1t/h）。

1.2 实验方法

1.2.1 蜗牛破壁液的制备。利用下雨天气，去菜园或路边草丛采集（捕获）蜗牛洗净即放在-45℃以下的冰箱中冷冻48 h，捣碎呈糊状后，按重量比1∶10加入经预冷的生理盐水充分搅拌后，用120目的尼龙纱布过滤，取滤液即用10%醋酸（以下简称HAc）调pH 5.6,滤渣晒干作饲料，前者于沸水中在搅拌下保温3～5 min(或有)混浊出现时，立即于流水下骤冷至常温，于8000 r离心15 min，取上层清液放冰箱保存待用，沉淀物与前滤渣併合作饲料。

1.2.2 蛋壳杀菌剂的制备：与餐饮店约定收集或购已被使用的废鸡蛋壳。依“1.2.1”类似方法，制备对已破壁的花粉液灭菌，（再于37℃水浴，保温30 min），对花粉糊杀菌消毒。

1.2.3 破壁及灭菌：取花粉，蜗牛破壁液，杀菌消毒剂，依1∶0.10∶0.10的比例，配制反应系统成糊，快速反应10～15 min。板框过滤机过滤或240目尼龙布袋吊滤，取滤液依1%加入吐温-20静置沉淀。花粉破壁后的残余物经干燥后用于制面条、饼干、面包。

1.2.4 花粉破壁效果的检测

(1)花粉破壁后反应液检测及破壁率：上述反应液以3000 r/min离心10 min，取清液1ml，加生理盐水3ml，稀释适当倍数，于260及280 nm测定紫外光吸收值[5]。

(2)显微镜观察破壁花粉表面形态变化：用接种针分别蘸取花粉破壁沉淀物于载玻片上，滴少量水匀开，盖上盖玻片，以 10×40、10×60 和 10×100 放大倍率于显微镜下观察。再与对照样品比较，分别统计5个视野，计算破壁率。

(3)电镜扫描观察:将破壁后的花粉用4%戊二醛（国产品）及多聚甲醛固定一周，然后用Tris缓冲液(pH 6.5)洗涤，乙醇梯度无水乙醇脱水后，即醋酸异戊酯脱水，真空干燥，喷金。送入扫描电镜于6000倍观察花粉破壁状态。

2 结果分析

2.1 花粉破壁前后液对紫外光吸收比较

蜗牛提取液对花粉破壁后，花粉粒内蛋白质及核酸等大分子物质通过被水解的孔道释放出来，对紫外光260、280 nm处的有明显吸收，未破壁者虽然也有吸收，但仅有小分子RNA吸收释放，而诸如大分子DNA来说，却难以排出并吸收特征波长的紫外光（表1）。

表1 花粉被蜗牛细胞提取物破壁后紫外光吸收的变化

紫外吸收分析表明，蛋白质与核酸是花粉中主要的生物化学成份，其中蛋白质约占细胞内含物的20～25%之间，核酸含量一般在32～1695 mg/100g之间。自然界中核酸的含量在1000 mg/100g，即相当于1%以上核酸的花粉约占一半以上。在蜗牛提取物作用下，花粉破壁面积大。破壁程度较方法(1)效率高，破损面积大，在于蜗牛消化道内含多种水解酶，不仅有能水解纤维素、肽聚糖和几丁质类的酶，而且含水解木质纤维素类酶等，水解物范围宽。从而能使花粉粒内核酸、蛋白质等大分子物质通过花粉壁较大破损处而被释放出来。尽管这些大分子的空间结构未改变，但造成花粉壁内外环境大分子分布状态的改变，使花粉壁外环境中的大分子吸收紫外光的量也增加。这一结果不仅表明了蜗牛组织提取物对花粉壁有多种水解酶，而且含水解花粉壁酶活性也高，使花粉破壁后对紫外光吸收值增加了30%以上，提高了对花粉的破壁效果，资源利用率和节能减排的利弊优于其他方法。

2.2 显微镜对花粉破壁外观变化状态的观察效果也优于对照组

图1 未破壁花粉电子显微镜照片（6000倍）

图2 破壁花粉的彗星电泳（动态激光散射图）

图3 大白菜花粉（6000倍）

图4 南瓜花粉（6000倍）

图5 萝卜花粉（6000倍）

通过显微镜镜头观察，发现花粉粒经蜗牛复合酶系提取物处理后几乎无完整花粉粒存在，用血球计数器任意抽取5个以上的视野分别计算未破壁和破壁数，破壁率均为100%。图1和图2分别为破壁花粉不同视野中的破壁状况。图中表明可以清楚地观察到花粉破壁前的状态，细胞壁几乎完好无损；图2是破壁花粉的彗星电泳（动态激光散射图）照片，从照片中可以看到，破壁花粉壁上有明显裂痕和缺损孔道，同时，伴随有细胞内含物的溢出破壁效果明显。

2.3 蜗牛破壁提取物破花粉壁方法的实用性

图6 破壁豌豆花粉（6000倍）

图7 破壁杜鹃花粉（6000倍）

图8 破壁萝卜花粉（6000倍）

图9 破壁花粉混合样

图10 花粉破壁前的花粉管

图3～图5分别扫描放大6000倍所采大白菜、南瓜、萝卜花粉的电子显微镜照片。从照片上（图6～图9）可以观察到，细胞外壁上都出现了破壁的裂痕并伴随内含物的溢出，表明蜗牛破花粉壁的方法对各类花粉均适用。图中清楚显示每类花粉粒破壁位置不同，所表现不同酶水解位置和孔隙大小不同，而且各位点的水解底物分布不同，这可能不仅取决于同一酶在花粉壁表明同一物质分布不同，而且不同酶在不同花粉壁上选择于相似点，但成分可能不同。

3 讨论

3.1 花粉破壁方法的选择与花粉壁的组成成分相关

（1）花粉壁的结构组成：花粉是显花植物雄蕊花粉囊内的活性粉状物，在一定环境条件下可被培养成单倍体植株，内含丰富的营养成分。花粉壁由内外二层壁构成。外层壁较厚而硬，缺乏弹性，主要成分为花粉素，其次是几丁质、果胶质、纤维素和半纤维素等。萌发孔和沟缝是外壁较薄的区域，是花粉管生长并伸出之处（见图8）。诺克斯等认为花粉素是胡萝卜素和类胡萝卜素酯的氧化聚合物，这种有机化合物组成极为复杂，依作者多年对不同花粉的研究和开发利用，认为这类化合物不仅极稳定并难氧化，而且对酸、碱、盐及酶的作用均为稳定，即使在300℃以上的高温也难以被裂解破坏[1]，花粉壁的内层较薄，软而有弹性，而在花粉孔处的内壁也常硬厚，其主要成分为木质纤维素、果胶质、几丁质、半纤维、蛋白质及少量肽聚糖等。最近课题组已研究出针对花粉壁结构复杂性的破壁复合酶系，现已付之应用(另作报道）。

（2）花粉壁中酶系的组成：组成花粉粒内外壁的成分与植物细胞内外壁不同，其中最大区别即不仅含有传递生物信息的活性酶类，而且内外壁的蛋白质性质来源和功能也完全不同，如转化酶、核糖核酸酶、酸性碳酸酶等只存在于花粉内壁，而脱氢酶、细胞色素氧化酶和蛋白酶类只分布于花粉的外壁。这些活性蛋白质若无外界条件的诱发激活时，则不能使花粉壁水解。因此，花粉壁的这些固有特性不仅影响人们对花粉营养物质的吸收利用，而且也限制了工业上对花粉粒内营养成分的提取利用，从而束缚了花粉的深层次开发[7,8]。

表2 蜗牛提取物破花粉壁与物理化学方法比较

3.2 蜗牛提取物破花粉壁的机制分析

蜗牛破花粉壁的提取物是一种以嗜草软体动物体液作分散相，生理盐水作提取介质的胶体液，其中水分占92%，蛋白质约占5%，矿物质为2%，所含矿物质为氯化钠和ZnSO4、Ca(HCO3)2等。有机物主要是构成各类酶蛋白质，蜗牛提取物是水解花粉壁相关酶（如纤维素复合酶、木质纤维素酶、几丁质酶、果胶酶等），灭菌剂原料为蛋壳膜上的溶菌酶，对来自蜗牛及原材料中真菌有较好的杀害作用，保障花粉破壁液卫生安全性，约占破壁复合酶系介质1.5%。

利用蜗牛消化系统提取能水解花粉壁的复合酶系是基于花粉是绿色植物体内合成的物质。尽管花粉壁有不同，但同一株植物其他组织细胞有各自特有组分，它也是由细胞中相关酶合成的。一旦花粉不能授精形成种子，而自我消亡再分解，所分解出的小分子化合物可重新利用。后者的分解也是酶的作用。因此，可以推想这些分解的酶类也存在于自然界。如作者用溶菌酶在有钙离子存在的状态下，可以较好的水解油菜类及十字花科类的花粉壁及向日葵花粉的沟，这样即可判别此油菜花粉壁上存在肽聚糖结构，发明了蛋壳蛋清提取物可对含肽聚糖的南瓜、油菜、黄瓜等植物的花粉，并于1989年获得国家发明奖。因此，使文中作者发现食草蜗牛组织液可用于破花粉壁，再以蛋壳提取物在对花粉破壁反应系统灭菌并强化花粉破壁的过程，拓展了花粉破壁效果。

3.3 蜗牛对花粉破壁与其他同类花粉破壁方法的比较

本法与当前国内外对花粉破壁方法相比，具有的优越性与其他方法比较如（表2）。

4 结论

蜗牛是食植物叶茎软体动物，对多种植物性材料有水解性，对花粉水解可行，较其他方法、材料来源广泛，技术设施及方案设计与同类方法比较，采集简便，可养殖，提取过程简单，效率高，规模不受限制；蛋壳、蛋清抗菌安全卫生，无废弃物，方法科学性好；全过程资源能充分利用不产生污染，耗能小，投资少，可推广，并能形成产业链，能又快又好地发展乡镇经济，优化养蜂业和家禽养殖的产业结构，有利于农林闲散劳动力就业，对发展花粉加工产业、促进农民闲散劳力创业和增加农民收入具有重要意义。

[1]张宽朝,段晓雪,Zhanguanchao,等.蛋清、蛋壳对花粉破壁作用的细胞学研究[J].食品工业科技,2010,31(6):136-138.

[2]罗曼,蒋立科.蛋清破花粉壁的研究[J].天然产物研究与开发,1999，(3):58-62.

[3]唐维,张星海.花粉破壁方法的研究进展[J].食品与发酵工业,2003,29(2):86-92.

[4]蒋立科.花粉的采集与利用[M].合肥：安徽科技技术出版社，1990.

[5]龙淑珍.花粉核酸测定方法[J].中国蜂业,2000，(5):5-6.

[6]刘克武,赵欣平.花粉的生物化学与营养保健 [J].蜜蜂杂志,2000，(2),11-13.

[7]吴定,路桂红.蛋壳和蛋清综合利用 [J].中国乳业,1996，(5):33-35.

[8]刘慧,王凤山,楚杰.蛋清溶菌酶部分酶学性质及酶活性的影响因素研究[J].中国生化药物杂志,2008,29(6):385-387.

Study on cytology of pollen-wall broken by a snail in the extracts

Xu Yi,Sun Minggang,Yang Shiyu,Chen Yunfei,Chen Zijun，Tao Wei
(Anhui agricultural university,school of forestry and landscape,Hefei 230036,China)

【Achievement'Background】The pollen is rich in nutrition so that it is called the"miniature plants'nutrition library",but because of the special structure of pollen wall,seven methods from physical,chemical and biolo-gical are difficult to break the wall thoroughly.It has effects important development and actual utilization.Even if it is heated to 300℃,nutrition is difficult to release from pollen.【Methods】The natural phenomenon that snails eat plants during the rainy days inspired us to raise a new way of dissolving the cell wall.In this project,first,we will reduce snails into particle sizes through cryogenic grinding at a temperature of minus 45°C and mix it with buffer solution(phosphate solution pH6.5,0.05mol)to meet the extract requirements.Then,we will get the clear supernatant by removing the precipitate through centrifugation,and we should adjust the pH of clear supernatant into 5.6.After that,we keep the solution in boiling water(100°C)until it gets turbid.Then,separate the liquid by centrifuge again after it restores normal temperature under the flowing water.Finally,We save it into the firdge to use.We can also use the mixture of eggshell and Na－Cl solution(1%)as materials to get the eggshell extract in the same way.After all these procedures,keep these two solutions refrigerated.Now,we can start the procedures of dissolving the cell wall.First,soak the pollen in the mixture of 1 part pollen solution and 1 part normal saline solution.Then,add snail extract and the eggshell extract in the part pollen solution and 1 part normal saline solution.Then,add snail extract and the eggshell extract in the pollen solution and 1 part normalsaline solution.Then,add snail extract and the eggshell extract in break between these two operations.Mix and sterilize the solution,and finally,we can get the job done.【Results】the results showed that after 30 min of reaction microscope and electron microscope,the broken rate is above 97%,the appearance of a clear hole or fissure,UV analysis showed that 260nm and 280nm long absorption value than broken before more than 30%;microscopic reaction solution containing bacteria<10(in Escherichia coli,each ml number)reaction the mixture is solid-liquid separation system,used for food processing or production of health care products.

wall-broken of pollen,snail extract,eggshell egg whites,the instantaneous boiling water degeneration process,solid-liquid centrifugal separation.

文章来源：大学生思想教育创新课题

许意（1995-），安徽农业大学林学与园林学院林学专业。

陶伟（1978-），助理研究员，从事林业方面的研究。