甲基营养型芽胞杆菌的研究进展

张妙宜+云天艳+周登博+冯仁军+起登凤+张锡炎

摘 要 甲基营养型芽胞杆菌是一种无致病性的细菌，对外界环境具有多抗逆性，作为芽胞杆菌属的“后起之秀”，被越来越多的应用于各行业中。本文主要从甲基营养型芽胞杆菌的生理生化特征、代谢产物及应用等方面论述其研究进展。

关键词 甲基营养型芽胞杆菌 ；特征 ；代谢产物 ；应用

中图分类号 Q93 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.09.013

Research Advances on Bacillus methylotrophicus

ZHANG Miaoyi1，2） YUN Tianyan2） ZHOU Dengbo1）

FENG Renjun1） QI Dengfeng1） ZHANG Xiyan1）

（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou 571101；

2 College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228）

Abstract Bacillus methylotrophicus is a non-pathogenic bacterium， and has a multiple resistance to the environment. As a "rising star" of bacillus， B. methylotrophicus has been gradually used in various industries. The advances in researches in physiological and biological characteristics and metabolite， and application of B. methylotrophicus were reviewed.

Keywords Bacillus methylotrophicus ； characteristic ； metabolite ； application

芽胞桿菌属（Bacillus）自1872年被德国微生物学家Cohn建立以来已有100多年研究历史，模式种为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis），细胞呈杆状或椭圆状，因其芽胞并非繁殖体而为特殊构造的休眠体，故命名中采用“胞”字而非“孢”[1]。芽胞具有耐高温抗辐射等特点，能有效抑制病菌的生长繁殖。随着多相分类技术的发展，已分化出大量的芽胞杆菌近缘新属。2010年，Munusamy Madhaiyan等[2]就首次从传统种植的水稻根际土壤中分离得到甲基营养型芽胞杆菌（Bacillus methylotrophicus），甲基营养型芽胞杆菌为厚壁菌门，芽胞杆菌纲，芽胞杆菌目，芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，广泛分布于自然界中，与枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rRNA基因序列同源率为98.2%～99.2%[3]，是属于能利用甲醇等非C-C键低碳化合物的甲基营养菌（methylotrophy）中的一类微生物，因其代谢产物的多样性、对外界环境因子的多抗逆性和无污染无毒害等优点，近年来被越来越多的运用于农业、医学、商业等领域。为能更深入认识了解甲基营养型芽胞杆菌的基本特性和研究进展，本文旨在就甲基营养型芽胞杆菌的生理生化特征、代谢产物及应用等方面进行综述。

1 甲基营养型芽胞杆菌的设立及其鉴别特征

甲基营养型芽胞杆菌的最早记载出现在M.Madhaiyan等[4]关于菌株CBMB205T的研究中，通过表型特征观察、生理生化鉴定、基因序列分析、DNA-DNA杂交试验将其描述为芽胞杆菌属的新种并命名为甲基营养型芽胞杆菌，与该属的其他种类一样具有利用低碳化合物的能力。2008年Boden等[5]证明兼性甲基营养菌代谢C1化合物的巨大潜力，并且作为在原核生物中发现的甲基营养菌有别于传统的细菌类别[6]。菌株CBMB205T是从水稻根际土壤中分离得到的能在高浓度甲醇环境下生长的具有产ACC脱氨酶能力的革兰氏阳性菌，经测定，DNA g+c含量为45.0 mol[2]，与枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌的摩尔分数差分别为14和9，可鉴定三者为同属不同种。

甲基营养型芽胞杆菌严格好氧，革兰氏阳性，细胞呈杆状，宽0.63～0.64 μm，长1.8～2.7 μm，芽胞椭圆形，具运动性。菌落在AMS培养基上28 ℃培养4 d生长直径为0.2～0.8 mm，呈奶白色半透明状，边缘整齐，表面凸起有褶皱。在表型特征上有别于其它属种，如：枯草芽胞杆菌呈灰白色或微黄色不透明状，表面粗糙，边缘不整齐；地衣芽胞杆菌为乳白色微透明状，表面凸起偏光滑，边缘整齐；解淀粉芽胞杆菌则是白色半透明状，表面光滑隆起，边缘不整齐。Bacillus methanolicus在NA和LB等多种培养基中均能生长。大量研究表明，不同的培养基成分和培养条件对不同的甲基营养型芽胞杆菌菌株生长有着不一样的作用，但总的来说，菌株在一定条件范围内适宜生长：CNaCl≤4.0%（浓度），温度20～45℃，培养液pH值为2.0～10.0，最佳生长温度和pH值分别为28℃和7.0。氧化酶试验、接触酶试验、硝酸盐还原试验和蛋白酶、果胶酶活性测定结果均呈阳性，吲哚试验、脲酶试验、精氨酸双水解酶试验、β-半乳糖苷酶试验和纤维素酶活性测定结果均呈阴性，能水解明胶、甘油、三丁酸和七叶苷，可利用的唯一碳源有甲醇、乙醇和三甲胺，可利用的唯一氮源有硝酸钾、硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、三甲胺、氰酸钾、硫氰酸钾、甘氨酸、L-丙氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酰胺、1-氨基环丙烷-1-羧酸[3]。endprint

2 甲基营养型芽胞杆菌代谢产物的多样性

微生物的正常生长与繁殖离不开自身的代谢作用，其代谢产物[7]的种类差异性又调节着生物体的生命活动。1945年Johnson等[8]首次发现枯草芽胞杆菌代谢产物具有抗菌功能，且代谢快、安全性能高、适用范围广、生产工艺简便，引起国内外科研人员对微生物产物多样性的广泛关注，之后陆续有专家学者从芽胞杆菌属中分离出抗菌蛋白、抗菌肽等代谢产物。枯草芽胞杆菌的代谢产物主要有核黄素、细菌素、伊枯草菌素；地衣芽胞杆菌的主要代谢产物有苯乙酸、β-甘露聚糖酶、碱性蛋白酶、β-苯乙醇、几丁质酶；解淀粉芽胞杆菌的主要代谢产物为表面活性素、伊枯草菌素、二磷酸硫胺素[9]。甲基营养型芽胞杆菌作为21世纪初发现的新种益生菌，同样具有很大的研究前景。

甲基营养型芽胞杆菌中的抑菌代谢产物常见的有：抑菌蛋白、蛋白酶、纤维素酶、氨肽酶、抑菌肽等。采俊香等[10]在抱茎苦荬菜中挖掘Bacillus methylotrophicus抗菌蛋白的拮抗及耐高温、耐酸碱能力，确定该蛋白类抑菌代谢物对番茄灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病均有明显拮抗效果，最高可达95.4%，培养条件控制在80℃以内、5≤pH≤10、紫外照射12 h，抑菌活性稳定；康兴娇等[11]从葡萄园土壤中筛选出的甲基营养型芽胞杆菌T3能产生蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素等抑菌物质，对葡萄霜霉病菌具有强烈抑制作用，通过田间试验，菌株T3发酵液的防效效果明显优于清水对照；武利勤等[12]在霍山石斛中分离筛选出具有强烈广谱抗菌活性的甲基营养型芽胞杆菌RA菌株可产生长素、嗜铁素、蛋白酶等抑菌物质；王洪梅[13]从江西鹰潭土壤样品中分离筛选到一株广谱活性强的甲基营养型芽胞杆菌N5，并优化其发酵条件研制成微生物菌剂，通过PCR扩增和HPLC-MC分析確定芬枯草菌素为主要拮抗物质。章宁娟等[14]通过48孔板发酵法筛选出高产3-羟基丁酮甲基营养型芽胞杆菌，并采用响应面优化培养条件，使3-羟基丁酮转化率提高5.81%，3-羟基丁酮产量达41.17 g/L，为微生物发酵工艺、改善食品风味研究提供研究机制；吕倩等[15]将来自南海深海的SHB114进行HPLC等系统纯化，确定该甲基营养型芽胞杆菌含脂肽类化合物bacillomycin Lc[16]，可抗植物病原菌；胡江春团队[17]从辽宁渤海海域海泥中筛选出一株BAC-9912经华北制药集团爱诺有限公司研制成新型微生物菌剂，其主要抑菌代谢产物为环脂肽类化合物，具有很强的广谱活性和安全性，是我国首例获批的甲基营养型芽胞杆菌9912母药及可湿性粉剂，有望取代进口化学农药在农作物综合防治方面的地位。

3 甲基营养型芽胞杆菌的应用研究

3.1 农业方面

一直以来，滥用化学农药使植物病菌对杀菌剂敏感度降低并产生一定的抗药性，导致农民防病害成本增加，严重影响作物产量，并且农药残留也使土壤环境、水体污染问题日渐突出，甚至进入食物链中影响人类健康。为了改变这一不良现象，以实现农业可持续化发展，越来越多的研究转向了生防菌剂的防害及增产功效上[18]。中国于20世纪70年代末开始微生物菌剂产业，近现代植物病理学家陈延熙教授提出的“植物体自然生态系”概念[19]及“增产菌”研究，为中国植物病害生物防治奠定了夯实的理论基础和应用依据，在土传病原菌生态学的基础上研究发展生物防治方法，正确树立了植物病害是因病原菌导致的植物体自然生态系失衡的观念[20]；中国农业大学梅汝鸿教授认为微生态学是对自然界中微生物群落的结构、功能和各种群之间互作关系的研究的新兴学科[21]，它囊括生物体自身代谢平衡体系、环境适应机制与人类健康等问题。以菌治菌[22]，将成为农业时代发展的主力军，有利于抑制病菌病害蔓延、改善土壤肥力和生态环境。目前，已有许多科研人员在不同的原材料中分离筛选出对植物病原菌具有明显拮抗效果的微生物菌株。黄华毅等[23]从枣树根际土壤中分离得到一株拮抗菌株STO-12，经过研究鉴定表明该菌株为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis），能同时抑制枣缩果病菌（Alternaria tenuissima）等3种病原菌且能分泌蛋白类和脂肽类抑菌物质；孙正祥等[24]从香蕉根际土壤中筛选出的地衣芽胞杆菌C-4对香蕉枯萎病菌的相对抑制率在76%以上。甲基营养型芽胞杆菌作为芽胞杆菌属的“后起之秀”，其在生物防治领域发挥的拮抗效果也不容小觑。谢学文等[25]从连作多年的黄瓜根际土样中筛选得到甲基营养型芽胞杆菌WF-3，并通过田间试验发现其对黄瓜炭疽病防效分别为68.14%和73.70%；黄霄等[26]指出了菜籽饼饼肥发酵液中分离筛选的BM-24菌株对多种植物病原菌具有高效拮抗作用，特别是对香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）的抑菌率达到80.4%。调整生防菌剂配方能同时达到防治病害和增加产量的目的，李学红[27]进行正交试验优化出甲基营养型芽胞杆菌可湿性粉剂的最佳配方，实现防治黄瓜灰霉病、增加产量与降低生产成本的目的；刘利强等[28]检测出30亿个/g甲基营养型芽胞杆菌可湿性粉剂500倍液药剂对黄瓜灰霉病防效最好，且安全性最高。

3.2 环境保护方面

利用生物法降解毒害刺激物质可以有效解决工业废水污染难题，如：甲醛降解[29]、甲醇降解[30]等。陆榆丰[31]系统考察了B.methylotrophicus对污水底泥中三聚甲醛（TOX）的降解功效；杨波等[32]将天津港富营养化水域分离筛选出的三株高效嗜盐微生物：嗜盐喜盐芽胞杆菌（Halobacillus halophilus）、海杆菌（Marinobacter sp.）、甲基营养型芽胞杆菌（Bacillus methylotrophicus）按3∶2∶1比例混合使用，可去除高盐废水中70%以上的化学需氧量（COD）。Pengfei Sun等[33]分离到一株可通过固化抑制蓝藻生长的Bacillus methylotrophicus；翟春梅[34]根据菌藻共生体系特点，从太湖铜绿微囊藻提取一株Ma-B1菌株，并通过GC/MS分析验证了Bacillus methylotrophicus 代谢物是影响菌-藻互作关系的重要因素；陈苏团队[35]的研究表明甲基营养型芽胞杆菌能有效解决土壤中滴滴涕（DDT）残留问题，具有修复土壤功能，并通过田间小区实验发现混合表面活性剂（十二烷基苯磺酸钠∶吐温80=2∶3）与甲基营养型芽胞杆菌联合可使土壤中DDT降解率从单独施用降解菌的47.05%提高至63.98%；唐昊[36]从沼液中筛选到一株编号为“65”的高产聚羟基脂肪酸酯（PHA）甲基营养型芽胞杆菌，并优化该功能菌的培养条件，为探索餐厨垃圾回收降解的可行性提供数据支撑。endprint

3.3 工業方面

李潭[37]通过平板划线法及高岭土悬浊法从广西大学池塘土样中筛选出一株稳定性能高、絮凝活性98.27%的甲基营养型芽胞杆菌C412，并优化其培养条件制成安全性能高、无污染的新型高分子微生物絮凝剂，为规模化工业应用提供有效思路；向军[38]从豆豉中分离到一株能使蛋白质脱苦的甲基营养型芽胞杆菌CC，优化培养后氨肽酶产量和酶活性均明显提高，这对以后工业研究具有一定的参考价值。

3.4 食品加工方面

国内外大量研究表明，甲基营养型芽胞杆菌因可将外界一氧化碳物转化为自身营养物质这一特性被广泛应用于食品发酵领域，胡宝东等[39]研究确定了甲基营养型芽胞杆菌水解酶在固态发酵产业（酱香型大曲）中的突出表现；田丹丹[40]提出了产L-丝氨酸甲基营养型芽胞杆菌在食品添加剂、饲料添加剂等方面的应用前景；吴燕燕等[41]研究发现，甲基营养型芽胞杆菌中抗菌肽对罗非鱼片有明显的保鲜防腐效果；唐晓星[42]对产蛋白酶的兼性厌氧甲基营养型芽胞杆菌NCU507进行发酵豆粕工业研究，确定其最佳发酵条件，为进一步研制饲用益生菌奠定基础。

3.5 养殖方面

李卓伟[43]为探索饲用微生物菌剂在降低养殖成本和提高养殖质量的可行性，从饲养28 d的还未喂食的健康雏鸡肠道黏膜中筛选出三株芽胞杆菌，其中两株为分别产蛋白质酶和纤维素酶的Bacillus methylotrophicus，后进行芽胞发酵条件优化和肉鸡饲养试验，较对照组测定结果相比，粪便中营养物质残留明显减少、肠道中有益菌群浓度升高，说明甲基营养型芽胞杆菌可抑制有害菌种群、促进机体营养吸收及增强免疫，有望降低饲养费用。田良等[44]在仿刺参饲养实验中利用从仿刺参自身消化道筛选的甲基营养型芽胞杆菌等制成复合益生菌悬液提高仿刺参生长率、消化酶活性及免疫力。张广亮[45]以土壤、奶牛瘤胃液为样品，同时分离到具有较高固氮活性的甲基营养型芽胞杆菌，表明它们能对动物消化系统具有重要作用，并且来源之广，可自然界中广泛存在。

3.6 医药方面

目前正处于“后抗生素时代”[46]，滥用抗生素已使病菌慢慢产生抗药性，传统的中药发酵方法因受环境等因素的影响，无法完全促使微生物菌释放其功效，培养优势菌种用以定植于宿主器官内，可调节微生态系统平衡，所以加强益生菌在药理学上的应用成了医学界的重要研究方向。郑榕等[47]为进一步了解药用植物内生芽胞杆菌的生物多样性，从武夷山夏枯草植株及根际土壤中分离得到2株甲基营养型芽胞杆菌；李润静等[48]研究发现甲基营养型芽胞杆菌SK21.002在30℃下pH为6.5的环境以接种量2%、装液量30%发酵21 h，代谢产物果聚糖蔗糖酶增加3.75倍，可促进肠道吸收、调节血糖。魏萌[49]运用多种发酵技术优化N-14黄芪发酵液，使黄芪多糖提取率提高57.31%，并通过动物实验验证该菌株具有生物转化能力，可抵抗环磷酰胺对人体器官造成的免疫抑制，经鉴定为甲基营养型芽胞杆菌，代谢产物为纤维素酶、木质素酶。B.methylotrophicus等益生菌可调节宿主体内外营养平衡、促进消化、抑制有害菌繁殖，具有一定的医疗保健功能，是取代抗生素的不二选择。

4 小结

目前，已有较多芽胞杆菌属的发展研究面世，但针对甲基营养型芽胞杆菌的综合论述还并未见报道，国内外关于甲基营养型芽胞杆菌来源介绍主要有土壤、受污染水质、植物根系、动物器官内壁、食材等，并主要分析该类益生菌的代谢产物作用及最佳培养条件，探索其在植物病原菌防治、作物增产保质、减肥减药等生物技术方面，土壤修复、水资源净化、工业污染防治等生态环境治理方面，水产养殖、动物饲养方面，食品加工、医疗保健和化工原料等方面的应用，较多的运用于农业推广上。当今世界已将生态农业模式列为可持续发展的主要趋势，化学农药带来的“三R”问题（“抗性”、“残留”、“再猖獗”）亟须解决，所以研制高效安全的综合性复合生物菌剂势在必行。另外在探究甲基营养型芽胞杆菌的抑菌性能时也应考虑其致病性，避免因病理学特征影响防效。在微生物广泛适存的自然界原料来源中分离得到更多新的甲基营养型芽胞杆菌，发现还未被挖掘的代谢产物种类，以及开发该菌种在工业制造业方面的应用等方面还可以做进一步的研究。

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