铁螯合剂通过抑制P-gp的表达促进乳腺癌化疗增敏

程曼，何坤，李晶，刘苹,2

1. 上海交通大学生物医学工程学院(上海，200240)2. 上海交通大学Med-X研究院(上海，200030)

铁螯合剂通过抑制P-gp的表达促进乳腺癌化疗增敏

程曼1，何坤1，李晶1，刘苹1,2

1. 上海交通大学生物医学工程学院(上海，200240)2. 上海交通大学Med-X研究院(上海，200030)

多重耐药和肿瘤转移是治愈肿瘤的两大障碍。上皮间质转化作为肿瘤转移的早期事件与化疗耐药相关。有研究表明铁促进乳腺癌的发展， 但是铁在乳腺癌化疗耐药中的作用尚不明确。经研究发现乳腺癌化疗耐药细胞系MCF-7/Adr细胞内的铁含量明显高于化疗敏感细胞MCF-7， 并且ABC 转运体P-gp和间质表型标志物的表达受细胞内铁水平的调控。铁螯合剂DFO靶向细胞内的铁会抑制P-gp的表达及药物泵出功能， 从而产生化疗增敏作用。因此靶向细胞内的铁可以作为克服乳腺癌多重耐药的潜在手段。

乳腺癌； 化疗耐药； 铁螯合剂； P-gp

0 引言

多重耐药是指在应用一种化疗药物以后对多种结构和作用靶点不同的化疗药物产生的交叉耐药[1]， 具有多重耐药表型的肿瘤细胞其特征为ABC转运体表达上调[2-4]。目前， 研究最广泛的与乳腺癌化疗耐药相关的ABC转运体是P-gp[5]， 这种ABC转运体通过将化疗药物泵出细胞外， 从而降低细胞内有效药物浓度介导化疗耐药[6-7]。因此， 同时检测P-gp的表达和功能在描述其在化疗耐药中的作用方面至关重要。

乳腺癌的一大特征是铁代谢相关蛋白的表达异常[8]。铁在DNA 修复、 细胞周期进展以及细胞存活中发挥着至关重要的作用， 而上述这些机制也是细胞多重耐药的形成机制。细胞铁代谢与化疗耐药的机制之间存在诸多交叉。具有高转移能力的细胞比正常细胞或者低转移能力的细胞具有更强的吸收铁的能力[9]。由于多重耐药细胞一般具有高转移能力， 我们假说多重耐药细胞内的铁含量高于化疗敏感细胞。

如果具有多重耐药表型的细胞内的铁含量较高， 那么靶向细胞内的铁可能是克服多重耐药的潜在手段。有研究指出， 铁螯合剂去铁胺DFO可以有效的抑制白血病细胞K562的P-gp表达[10]。铁螯合剂与标准化疗药物联用可以起到更强的杀伤肿瘤细胞的作用[11]。但是， 铁螯合剂是否会影响乳腺癌细胞的化疗耐药目前尚无报道。本研究旨在了解铁在乳腺癌化疗耐药中的作用， 研究乳腺癌转移的表型， 并且进一步探索靶向乳腺癌细胞中的铁是否影响肿瘤的化疗耐药性。

1 材料与方法

1.1 细胞系与人乳腺癌样本

本研究中主要采用了MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞。前者购自美国ATCC， 后者购自南京凯基生物科技发展有限公司。

7对乳腺癌样品来自瑞金医院， 接受4个疗程的化疗(环磷酰胺联合多柔比星及5-氟尿嘧啶)的乳腺癌病人。N表示样本为淋巴结转移病灶， T表示样本为原发肿瘤病灶。

1.2 细胞培养

MCF-7细胞培养在加入10%胎牛血清以及1%青霉素-链霉素双抗的DMEM 培养基中， MCF-7/Adr 细胞培养在加入终浓度为1 000 ng/mL阿霉素的含有10%胎牛血清以及1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液中。细胞均按一般贴壁细胞的体外培养方式进行， 二氧化碳浓度维持在5%， 温度为37℃。

1.3 免疫印迹

上样20 μg蛋白样品至10% SDS-PAGE胶电泳， 当溴酚蓝移动到距离底部大约0.5 cm时停止电泳， 电泳结束后将胶条转至PVDF膜。然后将PVDF膜置于1% BSA或5%脱脂奶粉中室温封闭1 h， 之后弃封闭液， 加入适量按比例稀释后的一抗溶液， 摇床上 4℃孵育过夜。次日， 回收一抗， TBST 洗3次， 每次10 min， 然后加相应 HRP-标记的二抗， 在室温下孵育 1 h， PVDF 膜上加入适量的增强化学发光显色液， 避光反应 5 min 后于化学发光成像仪中曝光。

1.4 细胞活性及IC50测定

MCF-7及MCF-7/Adr细胞汇合到90%， 常规胰酶消化后， 收集细胞。按96孔板每孔接种104个细胞的密度， 用排移液器将细胞悬液加入96孔板， 每孔100 μL。每个处理条件加4个复孔， 培养过夜后， DFO处理板的每孔细胞中加入终浓度为200 μM的DFO溶液。两块板中纵向4个复孔是一个加药浓度。MCF-7/Adr 细胞阿霉素的加药浓度梯度为30， 10， 3， 1， 0.3， 0.1， 0.03 μM。加入梯度浓度的阿霉素后， 培养72 h， CCK-8法测定细胞活性， 计算细胞活性和IC50值并且得到剂量效应曲线。

1.5 实时定量 PCR

采用Trizol试剂提取样品的总RNA， TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent kit进行反转录产生cDNA。RT-PCR引物设计使用Primer Express software 2.0及Invitrogen公司合成。引物序列为： 1) MDR1 的引物序列为forward: 5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3';reverse: 5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'。 2) 内参GAPDH 的引物序列为forward： 5'- GAGAGACCCTCACTGCTG-3'； reverse： 5'-GATGGTACATGACAAGGTGC-3'。TaKaRa公司的 SYBR Premix Ex Tag kit 进行qPCR反应。

1.6 电感耦合等离子体质谱仪测定法

将细胞铺在六孔板内， 在37 ℃、 5% CO2环境的培养箱内培养。待细胞长到70%时， 换培养液并加入DFO处理24 h。胰酶将细胞消化下来， 加1 mL PBS重悬， 细胞计数仪对每孔细胞进行计数并记录。1 000 转/分离心5 min 后去上清， 每管细胞加适量等体积硝酸消解。待细胞充分硝解后， 屈臣氏蒸馏水稀释使酸浓度低于2%， 消解ICP/MS的KED模式测定铁的含量。

2 结果

2.1 乳腺癌的化疗耐药与转移相关

近几十年来的研究指出， 转移和化疗耐药之间存在内在联系[12-13]。在本研究中， 7对成对的乳腺癌原位样本和相应的淋巴结转移样本用来分析转移和化疗耐药之间的联系。从图1(a)、 (b)中可以看出， 淋巴结转移的乳腺癌组织与原位组织相比其耐药相关蛋白P-gp表达更高。ABC转运体P-gp参与乳腺癌的化疗耐药[14]。在本研究中使用的乳腺癌化疗耐药细胞MCF-7/Adr中， P-gp的表达明显高于化疗敏感细胞MCF-7图1(c)， 提示我们MCF-7/Adr对阿霉素的耐药性可能由P-gp介导。为了进一步阐明转移和耐药之间的相关性， 我们进一步检测了化疗耐药和化疗敏感细胞的上皮间质转化标志物的表达情况。如图1(d)所示， 上皮表型标志物E-cadherin在化疗敏感细胞MCF-7中高表达， 但是在化疗耐药细胞 MCF-7/Adr 中完全缺失， 而间质表型标志物N-cadherin和Vimentin在MCF-7/Adr细胞中高表达， 但是在化疗敏感细胞MCF-7中不表达。上述结果提示化疗耐药细胞MCF-7/Adr具有间质表型， 而化疗敏感细胞MCF-7则是上皮表型。

2.2 化疗耐药细胞内铁含量高于化疗敏感细胞

本实验室已有的研究结果证实与上皮表型的乳腺癌细胞相比， 具有间质表型的乳腺癌细胞内的铁含量更高[15]。因此， 我们假说化疗耐药细胞MCF-7/Adr的铁含量高于化疗敏感细胞MCF-7， 并且铁与乳腺癌化疗耐药相关。为了证实该假说， 我们采用了两种方式检测细胞内的铁含量。首先， 我们分析了两种细胞铁代谢相关蛋白的表达情况。如图1(e)所示， 化疗耐药细胞中负责铁摄取的转铁蛋白受体 TfR及铁储存蛋白ferritin的表达均上调。上述结果提示化疗耐药的MCF-7/Adr 细胞中具有更多的铁。接下来， 我们利用电感耦合等离子体质谱仪进一步检测细胞内的铁含量。结果显示， 化疗耐药细胞 MCF-7/Adr内的铁含量明显高于化疗敏感细胞MCF-7图 1(f)。以上两种方法均证实化疗耐药细胞内的铁含量高于化疗敏感细胞。此外， 我们发现铁超载促进MCF-7/Adr细胞的化疗耐药及间质表型增强， 说明铁同时参与了乳腺癌的化疗耐药以及上皮间质转化。

图1 乳腺癌化疗耐药与转移相关并且化疗耐药细胞中铁含量增多Fig.1 Breast cancer chemoresistance was related with metastasis and chemoresistant breast cancer cells elevated iron content

2.3 铁螯合剂DFO促进化疗增敏并抑制间质表型标志物的表达

铁在能量代谢及DNA 合成中起到重要作用， 也就是说铁对细胞的存活和增殖至关重要。铁螯合剂DFO可以通过耗竭细胞内的铁从而引起细胞的死亡。那么耗竭细胞内的铁是否会促进已经发生化疗耐药的细胞对化疗药物增敏。从图2(a) 中可以看出， 200 μM DFO 可以明显上调 TfR 的表达， 并且下调ferritin 的表达， 说明细胞内储存的铁被耗竭， 细胞处于铁缺乏状态需要TfR通路的铁摄取。此外， 我们通过电感耦合等离子体质谱仪检测发现200 μM DFO 处理后细胞内的铁含量明显降低,见图2(b)， 这就直接证明了 DFO 处理可以降低细胞内的铁含量。接下来， 我们进一步检测DFO处理对MCF-7/Adr细胞阿霉素耐药曲线的影响以及其对细胞阿霉素IC50的影响。如图2(c)所示， DFO 使得 MCF-7/Adr 细胞的阿霉素剂量效应曲线明显左移， 并且对照组的 IC50是DFO处理组的616倍左右， 说明DFO在MCF-7/Adr细胞中起到了化疗增敏的效果。

在前文已经观察到铁超载促进乳腺癌细胞的间质表型标志物表达， 我们进一步分析了铁耗竭对细胞上皮间质转化的影响。如图2(d)所示， MCF-7细胞是上皮表型的细胞， 其上皮表型标志物 E-cadherin 的表达不受200 μM和 400 μM DFO的影响。但是对于具有间质表型的化疗耐药细胞MCF-7/Adr， 我们发现200 μM DFO处理明显下调其间质表型标志物vimentin 的表达， 而400 μM的DFO处理基本上完全抑制了vimentin的表达。上述结果提示铁螯合剂靶向细胞中的铁抑制间质表型标志物vimentin的表达， 并且具有剂量依赖性。综合上述结果， 靶向细胞内的铁可以同时抑制细胞的化疗耐药以及高转移间质表型。

图2 DFO 引起的细胞内铁耗竭促进MCF-7/Adr细胞化疗增敏并下调间质表型标志物的表达Fig.2 Iron depletion by DFO mediated resensitization to doxorubicin and downregulated expression of EMT-associated markers in MCF-7/Adr cells

2.4 DFO抑制 P-gp 表达及药物泵出功能

既然DFO起到化疗增敏的效果， 那么接下来我们需要探索的是其化疗增敏的潜在机制。首先， 我们前期的实验检测到DFO 本身不会引起 MCF-7/Adr 细胞的凋亡， 也不会影响其细胞活性。DFO 的化疗增敏效果不是由细胞凋亡介导的， 那么DFO产生的化疗增敏由何种机制介导？我们分析了DFO对MCF-7/Adr细胞P-gp表达的影响。如图3(a)所示， 与未经处理的 MCF-7/Adr 细胞相比， 200 μM DFO 处理后 MCF-7/Adr 细胞表达 P-gp 的比例降低， 并且western blot结果显示DFO明显抑制P-gp的表达,见图3 (b)。综上所述， DFO 引起细胞内的铁耗竭下调 P-gp 的表达可能是 DFO 引起化疗增敏的潜在原因。

细胞膜上 P-gp 的主要功能是将化疗药物泵出细胞外， 那么 DFO是否会抑制 P-gp 的物质跨膜转运功能？用2 mg/mL的阿霉素处理MCF-7/Adr细胞0.5 h， 使阿霉素装载入细胞内， 便于后续激光共聚焦荧光显微镜检测阿霉素在579 nm波长附近的自发荧光。如图3(c)、 (d)所示， 对照组细胞内阿霉素的荧光强度较弱， 说明阿霉素大部分被泵出细胞外， 存留在细胞内的含量较少。200 μM DFO处理 24 h后， 细胞内阿霉素的残留增多， 细胞内阿霉素的荧光明显增强， 且细胞内荧光分布不集中， 部分细胞内的阿霉素分布在细胞核内。而400 μM DFO处理 24 h， 细胞内阿霉素的荧光进一步增强， 而且大部分细胞内的阿霉素集中在细胞核内。由于阿霉素的作用机理是造成DNA损伤， 其分布在细胞核内才能达到有效的杀伤效果。由此可见， DFO耗竭细胞内的铁, 使细胞表面 P-gp 的功能受到抑制， 减少了阿霉素被泵出细胞， 使得细胞内存留阿霉素的浓度升高， 并且阿霉素集中在细胞核内， 起到更好的杀伤肿瘤细胞的效果。

图3 DFO下调MCF-7/Adr 细胞中P-gp的表达并抑制其药物泵出功能Fig. 3 DFO treatment down-regulated the expression of P-gp and inhibited its drug-export function in MCF-7/Adr cells

3 讨论

尽管肿瘤治疗的方案在不断推陈出新， 由于治疗过程中难免会发生化疗耐药， 乳腺癌的临床治愈率并未得到很大的提高。本研究旨在探索铁在乳腺癌化疗耐药中的作用机制， 研究乳腺癌转移的表型， 并且进一步探索靶向乳腺癌细胞中的铁是否影响肿瘤的化疗耐药性。主要研究发现： 1)转移到淋巴结的乳腺癌组织具有更高的P-gp表达， 并且化疗耐药的乳腺癌细胞E-cadherin缺失， vimentin高表达， 具有间质表型。2)ABC 转运体P-gp和间质表型标志物的表达受细胞内铁水平的调控。3)DFO引起的细胞内铁耗竭促进化疗增敏。4)DFO引起的化疗增敏可能由下调 P-gp表达以及阻断其药物泵出功能介导。

由于肿瘤化疗耐药是肿瘤转移和复发的根源， 多重耐药是成功治疗肿瘤最大的障碍。尽管在治疗肿瘤方面多种策略以及新的靶向性药物不断开发出来， 但是目前更为有效的抗化疗耐药的手段仍需探索。目前抗化疗耐药的主要研究方向是调节细胞表面ABC转运体的表达而开发不同的ABC转运体抑制剂[6]。但是， 目前没有能够跟常规化疗一起使用的ABC转运体抑制剂被批准使用， 因为这些ABC转运体都具有毒性方面的问题[16]。因此， 开发新的化疗增敏的药物是非常有价值的。因为铁在肿瘤的转移和化疗耐药中均起到重要作用， 靶向细胞内的铁可能是非常有前景的抗化疗耐药选择， 并且可能取得更好的临床治疗效果。

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Iron Chelator Promotes Breast Cancer Chemo-resensitization through Down-regulation of P-glycoprotein

CHENG Man1, HE Kun1, LI Jing1, LIU Ping1,2

1. School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University( Shanghai, 200240) 2. School of Med-X Research Institute, Shanghai Jiao Tong University( Shanghai, 200030)

Multidrug resistance and tumor metastasis are two major obstacles in successful treatment of cancer. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) as early event in cancer metastasis has been believed to induce chemoresistance. Some studies support that iron promotes the development of breast cancer. However, the role of iron in breast cancer chemoresistance has not been determined. In the present study, we found that intracellular iron concentration in chemoresistant breast cancer cell line MCF-7/Adr was much higher as compared to drug sensitive cell line MCF-7. The expression of ABC transporter P-glycoprotein and mesenchymal markers was regulated by intracellular iron level in MCF-7/Adr. Targeting iron by iron chelator Deferoxamine (DFO) exerted chemo-resensitization effect mediated by inhibition of P-gp expression and blocking the drug efflux function. Our findings suggested it would be appropriate to continue to investigate targeting iron as a promising strategy to overcome chemoresistance.

breast cancer, chemoresistance, iron chelator, P-gp

10.3969/j.issn.1674-1242.2017.03.002

程曼， E-mail:man311007@163.com

刘苹， E-mail: pingliu@sjtu.edu.cn

R737.9

A

1674-1242(2017)03-0135-05

2017-04-29)