抑制剂BYL719防治卵巢切除致骨质疏松症的研究

何晓刚

上海策乘生物技术服务公司(上海，200437)

抑制剂BYL719防治卵巢切除致骨质疏松症的研究

何晓刚

上海策乘生物技术服务公司(上海，200437)

目的 PI3K信号通路在破骨细胞前体细胞增殖、 破骨细胞分化中均发挥重要功能。BYL719是经典的PI3K通路抑制剂， 但其对骨代谢的影响， 目前未见报道。方法 通过构建卵巢切除后小鼠骨质疏松症模型， 运用microCT进行骨组织形态学分析， 研究BYL719对骨质疏松症的治疗作用。在此基础上， 通过体外研究BYL719对破骨细胞前体细胞活性、 破骨细胞分化、 破骨细胞特异性基因表达以及破骨细胞骨吸收功能， 明确BYL719对破骨细胞的功能。结果 BYL719在5 mg/kg和10 mg/kg浓度下， 均可有效防治小鼠卵巢切除导致的骨丢失， 可以抑制破骨细胞前体细胞活性， 抑制破骨细胞分化以及破骨细胞特异基因表达。结论 PI3K-mTOR抑制剂BYL719可通过影响破骨细胞前体细胞活性、 破骨细胞分化， 最终达到治疗骨质疏松症的作用。

骨质疏松症； PI3K抑制剂； BYL719

0 引言

骨质疏松症是一种影响中老年人健康的骨代谢性疾病， 以骨组织显微结构损伤， 骨密度下降， 骨质量降低为特征， 最终可因骨密度和骨质量的同时下降， 导致脆性骨折发生， 骨质疏松症患者脆性骨折的发生风险高达40%[1]。目前我国约有骨质疏松症患者9 000万人， 已成为世界上拥有骨质疏松症患者最多的国家[2]。随着社会发展和人口老龄化趋势加剧， 骨质疏松症的发病率进一步增高， 已成为威胁我国老年人群健康的重要慢性疾病。

导致骨质疏松症发生的主要病理机制， 包括成骨细胞骨形成功能的下降， 以及破骨细胞骨吸收功能的上升， 导致机体骨重建失衡， 净骨量减少， 造成骨质的净丢失。破骨细胞来源于骨髓单核-巨噬细胞系， 在RANKL(核因子κB受体活化因子配体)的刺激下， 激活NF-κB信号通路、 MAPK(JNK、 p38、 ERK)信号通路、 NFAT信号通路、 Src/PI3K/AKT信号通路等[3-6]， 促使破骨细胞分化成熟并发挥吸收骨质的作用。因此， 针对RANKL下游的信号通路， 研发抑制这些信号通路的小分子药物， 进而抑制破骨细胞骨吸收功能， 减少骨量丢失， 是治疗骨质疏松的一个方向。

PI3K-Akt-mTOR信号通路在破骨细胞分化成熟中发挥重要作用， 激活的PI3K 可磷酸化Akt蛋白， 进而通过下游效应器AFX/FOX04来抑制破骨细胞的凋亡[7-8]。因此， PI3K信号活化对于破骨细胞的存活至关重要， 但目前针对PI3K-Akt-mTOR靶点治疗骨质疏松的报道仍较少。BYL719是一种已知的PI3K抑制剂， 能够抑制肿瘤的PI3K活性从而达到治疗肿瘤的作用， 但其在破骨细胞中的作用， 未见报道。本研究旨在明确PI3K抑制剂BYL719在治疗破骨细胞相关骨质疏松症中的治疗作用， 以期为骨质疏松症的治疗提供新思路。

1 材料和方法

实验所用的α-MEM培养基、 胎牛血清购自Gbico公司； BYL719抑制剂购自Selleck公司， 在二甲基亚砜(DMSO)中溶解。MTS检测试剂盒购自Promega公司； 重组巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和重组RANKL购自R&D公司。

1.1 去卵巢骨质疏松小鼠模型的建立和药物治疗

取12周龄C57BL6小鼠32只， 随机分成4组， 包括假手术组， 去卵巢手术组， 去卵巢加低剂量(5 mg/kg)BYL719治疗组， 去卵巢加高剂量(10 mg/kg)BYL719治疗组。去卵巢手术采用背侧入路,依次切开皮肤, 皮下和肌层, 暴露腹腔, 切除双侧卵巢, 以丝线将残端结扎, 再逐层缝合关闭伤口。在成功去卵巢后1周， 结合文献BYL719在肿瘤动物实验中体内给药浓度， 按照5 mg/kg(低剂量组)和10 mg/kg(高剂量组)BYL719的浓度进行给药， 对照组给予无菌生理盐水。给药4周后， 小鼠处死并获取骨组织标本， microCT(ScanCoμ-100)按照10 μm分辨率扫描胫骨， 并分析胫骨骨小梁的骨体积分数(BV/TV)、 骨小梁数量(Tb.N)、 骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁间距(Tb.Sp)。

1.2 破骨细胞前体细胞体外增殖实验

取4到6周的C57BL6小鼠， 取股骨和胫骨， 冲出骨髓腔内细胞后， 将细胞种在T75 培养瓶中培养， 培养基为含30 ng/mL的M-CSF， 10%胎牛血清的alpha MEM， 隔天换液， 培养3～5 d， 可获得骨髓来源的单核巨噬细胞(BMM细胞)。按照8 000 个/孔的细胞密度， 接种到96孔板上， 给予不同浓度的BYL719， 并用MTS试剂盒观察BYL719对其增殖影响。

1.3 破骨细胞分化实验

按照6 000个/孔的细胞密度接种破骨细胞前体细胞， 细胞在含50 ng/mL RANKL、 30 ng/mL的M-CSF及10%胎牛血清的alpha MEM培养基中培养， 用不同浓度(0 nM～250 nM)的BYL719隔天刺激细胞， 培养5～7 d， 当对照组有明显的破骨细胞形成时， 终止培养， 用4%多聚甲醛固定细胞后， 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色， 在显微镜下， 计算多于3个细胞核， TRAP染色阳性的破骨细胞的数量。

1.4 破骨细胞特异基因表达实验

按照50万个/孔的细胞密度， 在6孔板中接种破骨细胞前体细胞， 同样采用RANKL、 M-CSF和不同浓度的BYL719刺激破骨细胞5～7 d， 至对照组中成熟的破骨细胞分化形成后， 提取RNA， 并用realtime PCR扩增破骨细胞特异的TRAP， Cathepsin K(Ctsk)， NFATc1， Calcitonin Receptor(CTR)等基因表达情况。

1.5 RT-PCR与Realtime-PCR

使用Trizol试剂分离细胞中的总RNA后， 用逆转录酶、 1 μg RNA模板和Oligo-dT引物合成cDNA， 随后PCR扩增破骨细胞相关基因， 或用SYBR Green(双链嵌合荧光染色)实时定量PCR检测破骨细胞相关基因表达。使用下列特定引物组织蛋白酶K(CTSK)(5'-GGGAGAAAAACCTGAAGC-3'; 5'-ATTCTGGGGACTCAGAGC-3')， 降钙素受体;( 5'-TGGTTGAGGTTGTGCCCA-3'; 5'-CTCGTGGGTTTGCCTCATC-3';), NFATc1(5'-CAACGCCCTGACCACCGATAG-3'， 5'-GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3')；TRAcP (Acp5)(5'-TGTGGCCATCTTTATGCT-3'， 5'-GTCATTTCTTTGGGGCTT-3')；GAPDH(5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3')。

1.6 统计分析

所有的实验数据分析采用Student'st检验方法，P值小于0.05被认为具有显著统计学意义。

2 实验结果

2.1 BYL719保护卵巢切除后骨丢失

BYL719是一种特异性的PI3K抑制剂， 在动物体内实验中， 可抑制肿瘤PI3K， 从而发挥治疗肿瘤的作用。但其在抗骨质疏松中的作用， 未见报道。我们首先建立了小鼠卵巢切除导致的骨质疏松症模型。如图1所示， 在对照组， 小鼠骨小梁骨量正常， 但是， 切除卵巢后5周， micro CT数据显示， 小鼠骨体积分数显著降低， 骨小梁厚度下降， 骨小梁数量减少， 骨小梁间距增加， 提示骨质疏松模型构建成功(图1(a)和图1(b))。在此基础上， 我们发现5 mg/kg和10 mg/kg的BYL719体内给药浓度， 给药4周后， 低剂量和高剂量的BYL719均可有效抑制卵巢切除导致的骨丢失， 与卵巢切除组相比， BYL719给药组骨量显著增高， 骨小梁数量增加， 骨小梁间距减少， 表明BYL719可以有效抑制卵巢切除的骨丢失(图1)。

(a) MicroCT扫描分析对照组(Sham),卵巢切除组(OVX),低剂量BVL719组(5 mg/kg)和高剂量BYL719组(10 mg/kg)对小鼠骨小梁的影响 (b)microCT分析上述四组骨形态参数， 表明BYL719能有效防治骨丢失， Sham组与OVX组比较。*P<0.05； OVX组与BYL719组进行统计学分析，#P<0.05

(a) MicroCT scan of the control group (Sham) and (OVX) demonstrated the successful generation of OVX-induced bone loss model. In addition, low dose and high dose of BVL719 prevented OVX-induced bone loss. (b) Analysis of the BV/TV and trabecular number, trabecular thickness, trabecular separation of the 4 groups indicated BYL719 can effectively prevent bone loss. *, Sham group and OVX group,P<0.05; #, OVX group and BYL719 group,P<0.05

图1 BYL719防治卵巢切除后骨丢失。
Fig.1 BYL719 prevents OVX-induced bone loss after OVX

2.2 BYL719对破骨细胞前体细胞增殖的影响

为了明确BYL719是否通过影响破骨细胞而发挥保护骨质疏松的作用， 我们首先在体外研究其对破骨细胞前体细胞活性的影响。如图2所示， 在500 nM的作用48 h和96 h后， BYL719均能有效抑制破骨细胞前体细胞活性， 表面破骨细胞前体细胞在500 nM及以上浓度时， 细胞增殖被抑制。但是， 在250 nM及以下浓度时， 细胞活性未受影响。该研究表明， BYL719能在500 nM以上浓度， 抑制破骨细胞前体细胞增殖， 但在500 nM以下浓度， 则无细胞毒性(图2)。

2.3 BYL719抑制破骨细胞分化

在此基础上， 我们进一步研究BYL719对破骨细胞分化的影响。在RANKL刺激下， 骨髓来源的单核巨噬细胞能够有效形成破骨细胞(对照组)， 而在无细胞毒性的浓度下， 低至62.5 nM， 125 nM以及250 nM的BYL719呈现浓度依赖性的抑制破骨细胞分化的趋势， 表面BYL719能有效抑制破骨细胞分化(图3)。

2.4 BYL719抑制破骨细胞基因表达

进一步基因表达研究表明， BYL719在不同浓度作用下， 可以有效抑制破骨细胞相关的基因(TRAP，CTSK，NFATc1和CTR)表达， 且呈现浓度依赖性趋势， 佐证了BYL719能有效抑制破骨细胞分化(图4)。

(a) 不同浓度BYL719对破骨细胞前体细胞刺激48小时后， MTS检测细胞活性 (b)不同浓度BYL719对对破骨细胞前体细胞刺激96小时后， MTS检测细胞活性(*,与对照组相比，P<0.05)

(a) The proliferation of osteoclast precursor was analyzed after 48hrs stimulation with different concentration of BYL719 (b) The proliferation of osteoclast precursor was analyzed after 96hrs stimulation with different concentration of BYL719. (*, comparing with control group,P<0.05).

图2 BYL719对破骨细胞前体细胞活性的影响。

Fig.2 The effect of BYL719 on osteoclast precursor proliferation

(a)不同浓度BYL719对破骨细胞分化的影响， TRAP染色检测形成的破骨细胞的数量(b)统计不同浓度BYL719处理后， 破骨细胞数量(*,与对照组对比，P<0.05)

(a) The effect of BYL719 on osteoclast differentiation (b) TRAP positive osteoclast number after the treatment with different concentration of BYL719 (*, comparing with control group,P<0.05)

图3 BYL719对破骨细胞分化的影响。

Fig.3 The effect of BYL719 on osteoclast differentiation

3 讨论

PI3K-Akt-mTOR信号通路在肿瘤中广泛研究， H1047R， E545K和H701P是三与肿瘤发生发展密切相关的PI3K突变， 因此， 针对PI3K的新型化合物研发是治疗肿瘤的一个重要方向， 目前有包括BYL719, NVP-BEZ235等在内的PI3K-mTOR特异性小分子抑制剂被不断研发并报道用于肿瘤的治疗。

PI3K-mTOR不仅仅在肿瘤中发挥重要作用， 其在破骨细胞相关的骨吸收中也发挥重要作用。PI3K被激活后， 可促使Akt活化并抑制凋亡基因的表达和增强抗凋亡基因的表达， 最终调节细胞的增殖、 分化、 存活和迁移等； Ke K等发现， TRAF6 可通过激活c-src从而刺激PI3K， 激活的PI3K 使Akt活化， Akt又通过下游效应器AFX/FOX04来抑制破骨细胞的凋亡[7-8]。因此， 抑制PI3K信号通路， 进而抑制破骨细胞的功能， 是治疗骨质疏松症的一个研究方向。

图4 不同浓度BYL719破骨细胞特异性基因表达的影响 Fig.4 The effecct on osteoclast specific gene expression affected by different concentration of BYL719

为此， 我们研究了PI3K抑制剂BYL719对破骨细胞相关的骨质疏松的作用。我们发现， 在有效治疗肿瘤的体内剂量下， BYL719也能在体内有效保护卵巢切除导致的骨丢失。进一步体外实验研究表明， 高浓度的BYL719处理下， 破骨细胞前体细胞活性明显受影响， 提示高浓度的BYL719通过抑制PI3K-Akt信号通路， 激活破骨细胞前体细胞凋亡而发挥部分作用。在此基础上， 在没有细胞毒性的低浓度BYL719作用下， 仍可有效抑制破骨细胞分化， 减少TRAP染色阳性的破骨细胞形成， 降低破骨细胞特异性的基因表达， 从而进一步发挥抑制破骨细胞相关骨丢失的作用。

综上所述， 本研究发现抑制肿瘤的PI3K抑制剂BYL719可通过抑制破骨细胞前体细胞增殖、 抑制破骨细胞分化等多方面作用， 发挥防止卵巢切除后骨丢失的作用。因此， PI3K抑制剂是治疗骨质疏松药物研发的一个新方向。

[1] Rachner T D, Khosla S, Hofbauer L C. Osteoporosis: now and the future[J]. Lancet, 2011, 377(9773):1276-1287.

[2] 盛辉, 李文君, 盛春君,等. 骨质疏松症诊治的转化医学研究进展[J]. 中国老年医学杂志, 2012, 31(8):641-645.

[3] Wood C L, Stenson C,Embleton N.The Developmental origins of Osteoporosis[J].Curr Genomics, 2016,16, 411-418.

[4] Harslof T, Langdahl B L. New horizons in osteoporosis therapies[J].Curr Opinion Pharmacol，2016,28, 38-42.

[5] Maraka S，Kennel K A. Bisphosphonates for the prevention and treatment of osteoporosis[J]. BMJ，2015, 351, h3783.

[6] Soares A P, do Espírito Santo R F, Line SR, et al. Bisphosphonates: Pharmacokinetics, bioavailability, mechanisms of action, clinical applications in children, and effects on tooth development[J]. Environm Toxicol Pharmacol, 2016, 42, 212-217.

[7] Liu T, Zhou W, Cai B, et al. IRX2-mediated upregulation of MMP-9 and VEGF in a PI3K/AKT-dependent manner[J]. Molecul Med Reports, 2015,12(3):4346-4351.

[8] Kuger S, Corek E, Polat B,et al. Novel PI3K and mTOR inhibitor NVP-BEZ235 radiosensitizes breast cancer cell lines under normoxic and hypoxic conditions[J]. Breast Cancer, 2014,8:39-49.

Inhibitor BYL719 Prevented OVX-induced Osteoporosis

HE Xiaogang

Shanghai Cersheng Biotechnology Service Company(Shanghai，200437)

Objective PI3K signaling pathway plays a pivotal role in osteoclast precursor proliferation, osteoclast differentiation. In addition, PI3K-mTOR specific inhibitor BYL719 hasn't been shown to affect bone metabolism. Methods In this study, we generated OVX-induced osteoporosis mice model and administrated 5 mg/kg and 10 mg/kg BYL719 in these mice. In addition, the effect of BYL719 on osteoclast precursor cell proliferation, osteoclast differentiation, osteoclast specific gene expression and bone-resorption was investigated. Results Both low and high dose BYL719 prevented OVX-induced osteoporosis, which can inhibit osteoclast precursor cell proliferation, osteoclast differentiation and gene expression. Conclusion PI3K-mTOR specific inhibitor BYL719 can prevent osteoporosis by inhibiting osteoclast precursor proliferation and osteoclast differentiation, indicating BYL719 as a potential candidate for the treatment of osteoporosis.

osteoporosis, PI3K inhibitor, BYL719

10.3969/j.issn.1674-1242.2017.03.003

何晓刚，E-mail:18958307777@189.cn

R587.7

A

1674-1242(2017)03-0140-05

2017-06-28)