HPLC-ELSD法测定益肺健脾颗粒中黄芪甲苷含量

张 丹 张红伟 杨 飞

郑州市食品药品检验所，河南郑州 450006

HPLC-ELSD法测定益肺健脾颗粒中黄芪甲苷含量

张 丹 张红伟 杨 飞

郑州市食品药品检验所，河南郑州 450006

目的建立益肺健脾颗粒中黄芪甲苷的含量测定方法。方法采用HPLC-ELSD法进行测定，色谱柱：Agilent C18（4.6mm×250mm，5μm），流动相：乙腈 - 水（32 : 68），流速：1.0mL/min，柱温：35℃，漂移管温度：100℃，气体流速：2.0mL/min；增益：1。结果黄芪甲苷在0.05245～0.4196mg/mL范围内线性关系良好（r=0.9999），平均加样回收率为95.52%（RSD=1.19%）。结论该方法简便﹑准确﹑可靠，可用于益肺健脾颗粒的质量评价及控制。

益肺健脾颗粒；黄芪甲苷；HPLC-ELSD

益肺健脾颗粒为黄芪﹑太子参﹑甘草﹑陈皮等组成的中药复方制剂，其中君药为黄芪，黄芪甲苷是黄芪的有效成分，具有免疫调节﹑器官保护﹑降糖﹑抗炎抗病毒等多种药理作用[1-2]。黄芪药材及含有黄芪的制剂多采用黄芪甲苷作为评价指标[3-16]。黄芪甲苷含量测定方法有薄层扫描法﹑高效液相色谱法等[5-16]。

目前，益肺健脾颗粒的质量标准是国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-11059（ZD-1059）-2002-2011Z，在标准中，黄芪甲苷的含量测定采用薄层扫描法。但薄层扫描法易受薄层板﹑环境温湿度及显色效果等因素的影响，导致测定结果重现性差。在《中国药典》2015版一部中，采用HPLC-ELSD法测定了黄芪药材及其收载多种中药复方制剂中黄芪甲苷的含量[3-4]，操作简便，稳定可靠。因此，本研究采用HPLC-ELSD法对益肺健脾颗粒中黄芪甲苷的含量测定方法进行考察和优化，并进行了方法学验证，为益肺健脾颗粒质量标准的完善及其质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；2000ES型蒸发光散射检测器（Alltech公 司）；Agilent ZORBAX SB-C18键 合 硅 胶 柱（4.6mm×250mm，5μm）；S205DμalRange型电子分析天平（梅特勒—托利多仪器有限公司）。KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），正丁醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），氨水（分析纯，洛阳昊华化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，美国Fisher公司），水（纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司）；黄芪甲苷对照品（批号：110781-200613，中国食品药品检定研究院）；益肺健脾颗粒（批号：160301，160302，160303，河南信心药业有限公司）。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水（32 :68）；流速：1.0mL/min；柱温：35℃，漂移管温度：100℃，气体流速：2.0mL/min；增益：1。

2.2 对照品溶液制备

精密称取黄芪甲苷对照品10.49mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为1.049mg/mL的对照品储备溶液。精密量取上述对照品储备溶液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度并摇匀，制成浓度为0.2098mg/mL的对照品溶液，滤过，即得。

2.3 供试品溶液制备

取本品适量，混匀，研细，取约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液蒸干，残渣加水25mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次30mL，弃去氨试液，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次20mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，分次转移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 黄芪阴性对照溶液的制备

根据该制剂处方中的比例，按照制法制备缺黄芪药材的阴性对照样品，按“2.3”项下的方法制备阴性对照溶液。

2.5 专属性试验

按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液﹑供试品溶液及阴性对照溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图（图1）。结果阴性对照溶液在黄芪甲苷色谱峰的相应位置上没有干扰，专属性强。

图1 高效液相色谱图

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 分别精密量取“2.2”项下的对照品储备溶液 0.5﹑1﹑2﹑3﹑4mL，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，使其浓度分别 为 0.05245﹑0.1049﹑0.2098﹑0.3147﹑0.4196mL/min。精密吸取上述5个对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件，记录峰面积。以对照品质量的对数（X）为横坐标，以峰面积的对数（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=1.4573X+6.2551，r=0.9999。结果表明，黄芪甲苷在0.05245～0.4196mL/min范围内线性关系良好。2.6.2 精密度试验 取“2.2”项下同一份对照品溶液，重复进样6次，每次10μL，记录峰面积。结果RSD为1.10%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 重复性试验 取同一批益肺健脾颗粒（批号：160301），按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，分别进样10μL，记录峰面积，计算含量。结果显示，黄芪甲苷的平均含量为0.1327mL/min，RSD为1.37%，表明该方法重复性好。

2.6.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在0﹑2﹑4﹑6﹑8﹑10﹑12h 进样 10μL，记录峰面积，计算得黄芪甲苷含量的RSD为0.95%，结果表明，该供试品溶液在12h内稳定。

2.6.5 加样回收率试验 取同一批益肺健脾颗粒（批号：160301），混匀，研细，分别取细粉6份，每份约5g，精密称定，分别于每份供试品细粉中加入黄芪甲苷对照品0.6294mg（即精密量取浓度为0.2094mL/min的黄芪甲苷对照品溶液3mL），按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，分别吸取10μL，记录峰面积，计算回收率，结果显示，平均回收率为95.52%，RSD=1.19%（n=6），符合定量分析的要求，测定结果见表1。

2.7 供试品含量测定

取益肺健脾颗粒3批（批号：160301，160302，160303），按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液5﹑10μL及供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算供试品中黄芪甲苷的含量。结果显示，益肺健脾颗粒（批号：160301，160302，160303）中黄芪甲苷的含量分别为0.1336﹑0.1357和0.1324mL/min。

3 结论与讨论

3.1 供试品溶液制备方法的确定

分别考察了超声提取法和回流提取法两种提取方法及提取溶剂﹑提取时间，结果确定甲醇超声提取30min最佳。

3.2 色谱条件的确定

参照《中国药典》2015年版一部“黄芪”药材及含有“黄芪”的成方制剂中黄芪甲苷【含量测定】项下的色谱条件与系统适应性试验[4-5]，并参考文献[7-16]中的相关方法，确定选用HPLC-ELSD法作为供试品的含量测定方法，并对该方法的色谱条件进行考察，根据供试品色谱中黄芪甲苷的分离效果，调整流动相中乙腈与水的比例。结果表明，流动性比例为乙腈-水（32 : 68）时，供试品中黄芪甲苷峰分离度良好，保留时间合适，且阴性对照溶液无干扰。因此，供试品中黄芪甲苷含量测定最优的色谱条件：流动相为乙腈-水（32 : 68），流速为1.0mL/min，柱温为 35℃。

表1 加样回收试验的结果（n=6）

3.3 蒸发光散射检测器参数的确定

为了基线平稳，且能达到含量测定的要求，本试验对ELSD漂移管温度﹑载气流速及增益等参数进行了优化。确定最优条件：漂移管温度为100℃，气体流速为2.0mL/min；增益为1。

综上所述，本试验建立的方法简便，灵敏度高，稳定性好，测定迅速，结果准确，故可作为益肺健脾颗粒质量控制的方法之一，为益肺健脾颗粒质量标准的进一步完善提供依据。

[1] Wang D，Liu J.Yifei Jianpi Granule improve lung function and immune function in elderly patients with COPD[J].World Chinese Medicine，2016，11（12）：2634-2640.

[2] 段立军，孙博航.黄芪甲苷的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2011，28（5）：410-412.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国中医药出版社，2015.

[4] 陈庆兴.甲状腺功能亢进对心房颤动高凝状态以及血栓塞事件的影响[M].上海：复旦大学，2012.

[5] Zhou J.Determination of astragalosideⅣ in liuweibuqi capsule by TLC-Scanning[J].Anhui Medi and Pharm J，2013，17（1）：37-38.

[6] Liu SJ，Zhao HF，Tang ZS，et al.Determination of Astragaloside Ⅳ in BuYangHuanWu Capsule by TLC[J].West J of Trad Chin Medi，2016，29（1）：30-32.

[7] Yang C，Qi JL，Zhou J.Determination of astragaloside in Qingliu granules by HPLC[J].West China J of Pharm Sci，2016，31（5）：533-534.

[8] Sun YH，Zhao J，Sun N.Determination of AstragalosideⅣ in Jianyaotong Granules by HPLC[J].China Modern Medicine，2016，23（33）：140-142.

[9] Han X，Zhu L，Yan CF，et al.Determination of AstragalosideⅣ in Yixinshu by HPLC-ELSD[J].Asia-Pacific Trad Med ，2016，12（1）：35-37.

[10] Hang HW，Cai YK，Wu ZG，et al.Content Determination of AstragalosideⅣ in Yangyin Shengjin Tablets by HPLC-ELSD[J].China Pharmaceuticals，2016，25（20）：53-55.

[11] WANG H，Yang CH，Song J，et al.Content Determination of Astragaloside Ⅳ in Kangshuan Tongluo Pills by HPLCELSD[J].China Pharmaceuticals，2016，25（4）：75-77.

[12] XIE ZW，TAN TL，WANG AP，et al.Content Determination of Astragaloside Ⅳ in Jianerbao Granules by HPLC-ELSD [J].China Pharmaceuticals，2016，25（13）：77-79.

[13] ZHU Y，HUANG YC，LAN XQ，et al.Determination of Astragaloside Ⅳ in Compound Armillaria Mellea Polysaccharide and Polypeptide Tablets by HPLC-ELSD[J].Pharm J Chin PLA，2017，33（3）：252-254.

[14] ZHANG XQ，LI Y，WU Y，et al.Quality control of Qiguitongfeng tablets[J].Chin J of New Drugs，2017，26（2）：169-173.

[15] Lin SJ，Cui YB，Xing ZX，et al.The HPLC ELSD Method Determination of Astragalus Armour Glycosides in Yigan Yiqi Jieyu Keli[J].Guid J of Trad Chin Med，2017，23（5）：47-49.

[16] Wang J，Feng JA，LI X，et al.Determination of Astragaloside Ⅳ in Guiqi Shengbai Granules by HPLCELSD [J].Asia-Pacific Trad Med，2017，13（5）：41-43.

Determination of astragaloside IV in Yifei Jianpi granules by HPLC-ELSD

ZHANG Dan ZHANG Hongwei YANG Fei
Zhengzhou Institute of Food and Drug Control,Henan 450006,China

ObjectiveTo establish a method for the determination of astragaloside IV in Yifei Jianpi granules.MethodsHPLC-ELSD method was used for the determination with chromatographic column: Agilent C18(4.6mm×250mm,5m),mobile phase:acetonitrile water(32 : 68),flow rate:1.0mL/min,column temperature:35 ℃ ,drift tube temperature:100℃,gas flow rate:2.0mL/min;gain:1.ResultsThe linear relationship of astragaloside IV between 0.05245-0.4196mg/mL range was good (r=0.9999),and the average recovery was 95.52%(RSD=1.19%).ConclusionThe method is simple,accurate and reliable.It can be used for the quality evaluation and control of Yifei Jianpi granules.

Yifei Jianpi granule;Astragaloside IV;HPLC-ELSD

R286

A

2095-0616（2017）19-41-03

2017-07-31）