脂肽的自组装特性及其与十二烷基麦芽糖苷的复配研究

李 泉，成 磊，于道永，徐 海

(中国石油大学(华东)化学工程学院 生物工程与技术中心，山东 青岛 266580)

脂肽的自组装特性及其与十二烷基麦芽糖苷的复配研究

李 泉，成 磊，于道永*，徐 海

(中国石油大学(华东)化学工程学院 生物工程与技术中心，山东 青岛 266580)

以组氨酸和十二烷酸为原料，合成了3种脂肽C12HH-COOH、C12HH-CONH2和C12HHH-CONH2，该类脂肽分子结构中都包含十二烷酸疏水烷烃链及组氨酸亲水肽链，具有传统表面活性剂和肽表面活性剂的结构特点。表面张力分析表明，3种脂肽在水溶液中都具有明显的表面活性剂特性，在MES缓冲溶液(20 mmol·L-1，pH=6.0)中的临界胶束浓度分别为0.40 mmol·L-1、0.63 mmol·L-1、1.10 mmol·L-1；随着缓冲溶液pH值的减小，脂肽亲水头基组氨酸侧链的带电性增强，临界胶束浓度逐渐增大。3种脂肽都能与传统表面活性剂十二烷基麦芽糖苷(DDM)复配自组装形成混合胶束，且混合胶束的平均粒径与复配体系中脂肽的含量有关。

脂肽；自组装；表面活性剂；复配

生物小分子如多肽、核苷酸等生物材料具有良好的生物相容性、生物活性以及生物可降解性等诸多优点，受到众多研究者的关注[1-4]。脂肽是一类烷基链与多肽片段通过酰胺键连接而成的多肽衍生物，结合了传统表面活性剂分子和肽表面活性剂分子的结构特点，不仅具有两亲性，还具有自组装特性。与传统表面活性剂分子相比，脂肽分子自组装的驱动力更丰富，可以在疏水作用、氢键作用、静电作用、π-π堆积作用等非共价键力的协同作用下自组装成各种纳米结构(如纤维、囊泡、纳米管、纳米层等)[5-8]，这些自组装体往往具有优越的生物学性能，在生物医药领域具有广阔的应用前景，所以脂肽分子的自组装研究意义重大。

目前，对脂肽自组装研究的报道较少。Privé课题组[9-10]设计合成了一类脂肽分子，但结构比较复杂，肽链较长，难以大规模制备，且在使用前必须实现脂肽的正确折叠，限制了其进一步应用。作者以组氨酸和十

二烷酸为原料，设计合成了3种结构相对简单的脂肽分子，并对其自组装特性及其与十二烷基麦芽糖苷(DDM)的复配进行了研究。

1 实验

1.1 试剂

脂肽C12HH-COOH(≥98%)、C12HH-CONH2(≥98%)、C12HHH-CONH2(≥98%)，自行合成；DDM(生物试剂)、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES，≥99%)、2-(N-吗啉)乙磺酸钠(≥99%)，Sigma-Aldrich公司；三氟乙酸、乙腈、磷酸、磷酸二氢钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；4-羟基-α-氰基肉桂酸(生物试剂)，上海恒远生物科技有限公司；超纯水。

脂肽和DDM的分子结构如图1所示。

图1 脂肽和DDM的分子结构Fig.1 Molecular structures of lipopeptides and DDM

1.2 溶液的配制

分别配制500 mL 20 mmol·L-1(pH=6.0/pH=6.5)MES缓冲溶液、500 mL 20 mmol·L-1(pH=3.0)PBS缓冲溶液、10 mL 10% DDM溶液。

分别配制一系列梯度浓度的脂肽溶液，静置24 h，观察溶液中是否产生沉淀。将DDM溶液与3种脂肽溶液分别按照10∶1和5∶1的比例进行复配，复配体系中DDM浓度为1.0 mmol·L-1，静置24 h，观察复配体系中是否产生沉淀。

1.3 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析

用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(Microflex LRF,Bruker)从分子量角度对3种脂肽进行MALDI-TOF-MS分析。首先，将脂肽和基质(4-羟基-α-氰基肉桂酸)以合适的比例溶于超纯水(含1%三氟乙酸)-乙腈溶液(1∶1，体积比)中；然后，取1 μL点在靶板上，待溶剂挥发后在自然条件下结晶；最后，将靶板放入质谱仪，用MALDI源的激光照射，单次扫描50～100次，累加信号后得到质谱图。

1.4 反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析

用Waters 2695 Alliance型反相高效液相色谱系统对3种脂肽进行RP-HPLC分析。称取一定量的脂肽，加入超纯水，配制成1 mmol·L-1的样品溶液，涡旋并振荡超声使其溶解，上样前需用孔径0.22 μm的滤头过滤。脂肽通过疏水作用吸附到C18反相色谱柱上，增大洗脱剂的疏水性来进行洗脱。流动相为含有0.1%三氟乙酸的超纯水溶液(A相)和含有0.1%三氟乙酸的乙腈溶液(B相)，40 min内梯度洗脱到95%的乙腈，柱温25 ℃，流速0.8 mL·min-1，时间45 min，紫外检测器，210～400 nm全波长检测。

1.5 临界胶束浓度(CMC)的测定

CMC是研究表面活性剂聚集行为的重要参数之一。与传统表面活性剂类似，当脂肽浓度低于CMC时，其在溶液中主要以单体形式存在；当达到CMC时，脂肽开始聚集形成胶束，进而开始组装。配制一系列梯度浓度的脂肽溶液，在表面张力仪(EasyDyne,Kruss)上采用Wilhelmy板法测定溶液的表面张力。以表面张力对浓度作图，拐点对应的浓度即为脂肽在缓冲溶液中的CMC。

1.6 胶束粒径的测定

复配表面活性剂具有单一表面活性剂不具备的性能和功能，因此不同表面活性剂之间的复配备受关注[11-12]。采用动态光散射仪(Nano-ZS,Malvern)测定复配体系胶束粒径。样品溶液用孔径0.22 μm的滤头过滤，设定温度25 ℃，稳定时间120 s，每个样品测定20次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 分子量及纯度分析

3种脂肽的MALDI-TOF-MS数据分析见表1。

表1脂肽的理论出峰位置与实际出峰位置

Tab.1Theoreticalvaluesandactualvaluesofthelocationoflipopeptidespeaks

从表1可知，3种脂肽分子带有一个正电荷的分子离子[M+H]+理论值与实测值的差值很小，在测量误差内相吻合，证明合成的脂肽是设计的目标脂肽。

3种脂肽的RP-HPLC图谱如图2所示。

图2 脂肽的RP-HPLC图谱

从图2可以看出，3种脂肽的RP-HPLC图谱均只有一个主峰，说明合成的脂肽纯度较高(HPLC纯度≥98%)，满足实验要求，可以用于自组装特性研究。

2.2 表面张力分析

3种脂肽在MES缓冲溶液(20 mmol·L-1，pH=6.0)中的表面张力随浓度变化曲线如图3所示。

图3 3种脂肽在MES缓冲溶液中的表面张力随浓度变化曲线Fig.3 Variation curves of the surface tension of three lipopeptides in MES buffer solution

从图3可以看出，3种脂肽C12HH-COOH、C12HH-CONH2和C12HHH-CONH2在MES缓冲溶液(20 mmol·L-1，pH=6.0)中均表现出明显的表面活性剂特性，其CMC分别为0.40 mmol·L-1、0.63 mmol·L-1、1.10 mmol·L-1。

脂肽C12HH-COOH在不同pH值缓冲溶液中的表面张力随浓度变化曲线如图4所示。

从图4可以看出，脂肽C12HH-COOH的CMC随着溶液pH值的增大而减小，在pH=3.0的PBS缓冲溶液中为5.00 mmol·L-1，在pH=6.0的MES缓冲溶液中为0.40 mmol·L-1，在pH=6.5的MES缓冲溶液中为0.06 mmol·L-1。这可能与不同pH值溶液中脂肽C12HH-COOH亲水头基(组氨酸)的带电情况有关。组氨酸的等电点pI约为7.6，R基的pKa约为6.0。因此，在pH=3.0时R基带一个正电荷；在pH=6.0时R基平均带0.5个正电荷；在pH=7.6时R基不带电荷。即脂肽C12HH-COOH所带正电荷量随着pH值的增大而减少，亲水性减弱，导致CMC减小。

图4 C12HH-COOH在不同pH值缓冲溶液中的表面张力随浓度变化曲线Fig.4 Variation curves of the surface tension of C12HH-COOH in buffer solutions with different pH values

脂肽C12HH-CONH2和C12HHH-CONH2的亲水头基也是由组氨酸构成，因此，它们的CMC同样随着pH值的增大而减小。

2.3 胶束粒径分析

将DDM与3种脂肽分别按10∶1和5∶1的比例进行复配，测定不同复配体系的胶束粒径，结果见表2。

表2不同复配体系的胶束粒径

Tab.2Theparticlesizeofmicelleindifferentcomplexsystems

复配体系平均粒径/nm标准偏差DDM(1mmol·L-1)5.070.27DDM∶C12HHCOOH=10∶14.800.33DDM∶C12HHCOOH=5∶14.680.27DDM∶C12HHCONH2=10∶14.610.17DDM∶C12HHCONH2=5∶14.390.20DDM∶C12HHHCONH2=10∶15.170.35DDM∶C12HHHCONH2=5∶15.310.10

从表2可知，在不同复配体系中均能检测到胶束的存在，其中DDM与C12HH-COOH、C12HH-CONH2复配后的胶束平均粒径比DDM小，DDM与C12HHH-CONH2复配后的胶束平均粒径比DDM大。这可能是由于，C12HH-COOH和C12HH-CONH2分子比DDM分子短(图1)，所以复配后的胶束平均粒径比DDM小，且复配后的胶束平均粒径随脂肽含量的增加逐渐减小；而C12HHH-CONH2分子比DDM分子长(图1)，故复配后的胶束平均粒径比DDM大，且复配后的胶束平均粒径随着脂肽含量的增加逐渐增大。

3种复配体系的胶束示意图如图5所示。

图5 3种复配体系的胶束示意图Fig.5 Schematic diagram of micelles in three complex systems

3 结论

以组氨酸和十二烷酸为原料，设计合成了3种脂肽C12HH-COOH、C12HH-CONH2和C12HHH-CONH2。表面张力分析表明，3种脂肽在水溶液中都具有明显的表面活性剂特性。3种脂肽在MES缓冲溶液(20 mmol·L-1，pH=6.0)中都能形成胶束，且3种脂肽的CMC随着缓冲溶液pH值的增大而减小。3种脂肽都能与DDM复配自组装形成混合胶束，且混合胶束的平均粒径与复配体系中脂肽的含量有关。

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Self-AssembleCharacteristicsofLipopeptideandItsComplexwithn-Dodecyl-β-D-Maltoside

LI Quan,CHENG Lei,YU Dao-yong*,XU Hai

(CenterforBioengineeringandBiotechnology,CollegeofChemicalEngineering,
ChinaUniversityofPetroleum(EastChina),Qingdao266580,China)

Using histidine and dodecanoic acid as raw materials,we synthesized three lipopeptides C12HH-COOH,C12HH-CONH2，and C12HHH-CONH2.Molecular structures of such lipopeptides contain dodecanoic acid hydrophobic alkane chain and histidine hydrophilic peptide chain,therefore they have the structural features of traditional surfactants and peptide surfactants.The surface tension analysis indicated that,three lipopeptides exhibited significant surfactant properties in aqueous solution,and the critical micelle concentrations(CMC) in MES buffer solution(20 mmol·L-1,pH=6.0) were 0.40 mmol·L-1,0.63 mmol·L-1,and 1.10 mmol·L-1,respectively.As the pH value of MES buffer solution decreased,the chargeability of the hydrophilic head group histidine side chain and the CMC increased.Three lipopeptides were able to form mixed micelles by self-assembly with the traditional surfactantn-dodecyl-β-D-maltoside(DDM),and the average particle size of mixed micelles was related to the lipopeptide content of complex system.

lipopeptide;self-assembly;surfactant;complex

O69

A

1672-5425(2017)10-0016-04

国家自然科学基金项目(21673292)，山东省自然科学基金项目(ZR2014BM013)，教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(20130133110011)

2017-06-01

李泉(1991-)，男，山东胶州人，硕士研究生，研究方向：生物能源，E-mail:S15030507@s.upc.edu.cn；通讯作者：于道永，副教授，E-mail:daoyong@upc.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.004

李泉，成磊，于道永，等.脂肽的自组装特性及其与十二烷基麦芽糖苷的复配研究[J].化学与生物工程，2017，34(10)：16-19，31.