南极冰藻DNA光修复酶脂质体的制备及其质量评价

李 然，陈 璐，齐 娟，金 青，缪锦来

(1.青岛科技大学，山东 青岛 266042；2.国家海洋局第一海洋研究所，山东 青岛 266061；3.青岛海洋科学与技术国家实验室，山东 青岛 266235；4.青岛大学，山东 青岛 266071)

南极冰藻DNA光修复酶脂质体的制备及其质量评价

李 然1，2，陈 璐1，2，齐 娟1，金 青1，缪锦来2，3，4*

(1.青岛科技大学，山东 青岛 266042；2.国家海洋局第一海洋研究所，山东 青岛 266061；
3.青岛海洋科学与技术国家实验室，山东 青岛 266235；4.青岛大学，山东 青岛 266071)

以包封率为评价指标，氯仿-乙醚混合溶剂(2∶3，体积比)为有机相，固态大豆卵磷脂和胆固醇为膜材，采用逆向蒸发法制备南极冰藻DNA光修复酶脂质体。经单因素实验和正交实验确定光修复酶脂质体的最佳制备工艺条件为：膜材比3∶1、药脂比1∶10、油相与水相体积比4∶1、超声时间6 min，在此条件下，光修复酶脂质体的平均包封率达到(44.13±2.90)%。所制得的光修复酶脂质体呈圆形或椭圆形，平均粒径为(490.9±2.3) nm，Zeta电位在-30～-60 mV范围内，制剂的质量标准符合中国药典(2015版)要求，为DNA光修复酶在日用防晒品中的应用提供了可靠的理论依据。

脂质体；包封率；南极冰藻DNA光修复酶脂质体；正交实验；质量评价

近年来，关于光修复酶在动物和人体细胞中的修复活性研究越来越多。Decome等[1]通过人体皮肤角质层细胞的实验研究证实，光修复酶能够有效地修复紫外辐射形成的CPDs产物，减少单链受损 DNA。Stege等[2]利用大肠杆菌表达Anacystisnidulans的光修复酶，将其应用于经过紫外辐射的皮肤上，发现光修复酶可以有效地减缓由紫外辐射引起的皮肤过敏反应。Berardesca等[3]进一步研究发现，在传统的防晒霜中添加Anacystisnidulans光修复酶能够增强对皮肤的保护作用，避免紫外辐射对皮肤的损害。

本实验室研发的南极冰藻DNA光修复酶作为一种新型的生物活性成分，主要起着防护和修复紫外线损伤的功能。与一般的传统护肤品不同，南极冰藻DNA光修复酶的防护机理是一个主动的修复过程，主动修复皮肤细胞内因紫外辐射而产生的嘧啶二聚体，从而保护皮肤，防治黑色素瘤和皮肤癌等紫外线损伤所引起的恶性疾病。传统防晒护肤品主要对紫外线起到一个“防”的作用，而光修复酶起到了“治”的目的，即可以修复受损细胞的DNA结构。随着人们对紫外线损伤皮肤机理研究的不断深入，防晒护肤品从传统的防晒逐步向基因修复方向转型，南极冰藻DNA光修复酶成为了研究热点。

脂质体(liposomes)是由一种或多种两亲性分子双层膜包裹而成的具有一个或多个水性腔室的微泡，脂质体直径一般在25～1 000 nm之间，处于胶体范围，呈高分散均匀状态，稳定性高，外观色泽透明，具有“丁达尔”现象。将药物包裹或镶嵌在脂质体中可得到脂质体药物，主要通过包封率、包封药物泄露粒径及粒度分布等评价其物理稳定性，药物的包封率是评价脂质体制剂质量的重要指标[4]。光修复酶不同于普通药物，在制备过程中酶活性会受温度、pH值等因素的影响，因此，在制备光修复酶脂质体时不仅需要保证一定的包封率，还要最大限度地保证光修复酶的活性不受损失。

以包封率为评价指标，以氯仿-乙醚混合溶剂为有机相，以固态大豆卵磷脂和胆固醇为膜材，采用逆向蒸发法制备南极冰藻DNA光修复酶脂质体(以下简称光修复酶脂质体)，通过单因素实验和正交实验对光修复酶脂质体的制备工艺进行优化，并对所得光修复酶脂质体进行了质量评价。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

南极冰藻DNA光修复酶，自制。

牛血清白蛋白，索莱宝；其余试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

UV2550型紫外分光光度计，日本岛津公司；JEM-2100型透射电子显微镜，日本电子公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质含量的测定[5]

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。考马斯亮蓝染料在酸性条件下为游离状态，呈红色，在460 nm处有吸收；与蛋白质结合后呈深蓝色，在595 nm处有吸收[6]；蛋白质浓度在一定范围内与595 nm处吸光度呈线性关系，据此测定蛋白质含量。

标准曲线的绘制:配制0.1 mg·mL-1牛血清白蛋白标准溶液，精密移取100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL、700 μL、800 μL，定容，加入考马斯亮蓝G-250溶液，测定595 nm处吸光度，以牛血清白蛋白浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2 包封率的测定

因为蛋白质等大分子的包封率较低，只有部分是包封进脂质体里的，大部分是游离状态的，直接测定药物含量会影响检测结果的准确性。故采用超速离心法先分离游离的蛋白质和脂质体[7]，再按照中国药典(2015版)计算包封率。

1.2.3 光修复酶脂质体的制备工艺优化

首先以光修复酶脂质体的成膜状态和稳定性为评价指标，选择适宜的膜材；以有机溶剂的物理性质和溶解膜材的能力以及成膜情况为评价指标，选择适宜的有机相；以粒径、PDI、包封率为评价指标，选择适宜的制备方法[8-10]；然后以包封率为评价指标，采用单因素实验考察缓冲液pH值、膜材比(固态大豆卵磷脂与胆固醇的质量比)、药脂比(光修复酶与固态大豆卵磷脂的质量比)、油相与水相体积比、超声时间对包封率的影响；最后在单因素实验的基础上，以膜材比、药脂比、油相与水相体积比、超声时间为考察因素，进行L9(34)正交实验，优化光修复酶脂质体的制备工艺。

1.2.4 光修复酶脂质体的质量评价

从形态、平均粒径及分布、Zeta电位及分布、稳定性、包封的光修复酶活性等方面对光修复酶脂质体进行质量评价[11]。

包封的光修复酶活性参照王玉珍等[12]的DNA光修复酶活性检测方法。单链核苷酸d(pT)16在265 nm处有吸收，经100 μW·cm-2紫外照射后会形成嘧啶二聚体，嘧啶二聚体在265 nm处没有吸收，单链核苷酸引物的吸光度随之减小。DNA光修复酶可以使嘧啶二聚体解聚形成单链核苷酸，使引物在265 nm处的吸光度增大。故可以根据嘧啶二聚体的解聚程度，即265 nm处吸光度的变化来判断光修复酶活性大小。

2 结果与讨论

2.1 蛋白质标准曲线

以牛血清白蛋白浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。

图1 牛血清白蛋白的标准曲线Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

对图1曲线进行线性回归分析，得到回归方程：A=0.00801c+0.00486，R2=0.99928，牛血清白蛋白浓度在10～80 μg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好。

2.2 光修复酶脂质体的制备工艺优化

2.2.1 膜材的选择

分别选择液态大豆卵磷脂和固态大豆卵磷脂作为膜材制备光修复酶脂质体。从外观上看，2种光修复酶脂质体均可溶于有机相并可形成澄清透明的淡黄色液体，旋转蒸发有机溶剂后成膜均匀，贴于器壁上，但水化过程中固态大豆卵磷脂较易从器壁上洗脱。放置10 d后，以液态大豆卵磷脂制备的光修复酶脂质体易发生聚集融合，有少量的胆固醇析出，而以固态大豆卵磷脂制备的光修复酶脂质体呈稳定的乳白色混悬液。综合两者的成膜状态和稳定性，选择固态大豆卵磷脂作为膜材。

2.2.2 有机相的选择

对比氯仿、乙醇、乙醚3种有机溶剂的物理性质(沸点、密度、毒性)和溶解膜材的能力以及成膜情况发现：乙醇来源方便、安全，但对膜材的溶解能力不佳并且成膜过程中会析出胆固醇，并不是理想的成膜材料；乙醚对膜材的溶解性和成膜性较好，但沸点太低，挥发太快，在旋转蒸发过程中需要严格控制温度；氯仿因密度较大，与水混溶不易形成W/O型乳剂。参考有机相的密度，氯仿与乙醚的体积比为2∶3时与水的密度相近，超声过程中更易形成稳定的W/O型乳剂，可提高药物的包封率，因此，选择氯仿-乙醚(2∶3，体积比)作为有机相。

2.2.3 脂质体制备方法的选择

以粒径、PDI、包封率为评价指标，对3种制备方法进行比较，结果见表1。

表13种制备方法的比较

Tab.1Comparison of three preparation methods

由表1可知，根据粒径分析，逆向蒸发法最佳，原因是逆向蒸发法制备的光修复酶脂质体的内水相体积大，导致粒径小[13]；PDI反映了分散体系的稳定程度，根据PDI分析，逆向蒸发法制备的光修复酶脂质体最稳定，其次是薄膜分散法，最不稳定的是乙醇注入法；根据包封率分析，薄膜分散法和逆向蒸发法相差不大。鉴于逆向蒸发法适合于包封水溶性药物和分子量较大的生物活性物质[14]，选择逆向蒸发法作为光修复酶脂质体的制备方法。

2.2.4 单因素实验结果

2.2.4.1 缓冲液pH值对包封率的影响

磷脂成分在pH值为6.5时最稳定，水解速率常数最小[15]。同时pH值的改变会使脂质体药物发生相分离，膜上形成孔洞或发生膜融合，脂质体内包封的药物会迅速渗漏，从而影响脂质体药物的稳定性[16]。因此，适宜的pH值可以维持脂质体药物的稳定性和减缓磷脂水解速度，故在制备脂质体药物时常加入缓冲液，使pH值处于脂质体药物最稳定的pH值范围内。缓冲液pH值对包封率的影响如图2所示。

由图2可以看出，当缓冲液pH值为7时脂质体的包封率最高。

2.2.4.2 膜材比对包封率的影响(图3)

由图3可以看出，包封率随着膜材比的增大先升高后降低，在膜材比为3∶1时包封率最高。这主要是因为：一方面当固态大豆卵磷脂量过大时，水化较困难，易凝聚，导致包封率下降[17]；另一方面当胆固醇量过大时，脂质体膜亲水性增强、膜易被破坏，导致内水相的药物渗漏[18]，包封率下降。

图2 缓冲液pH值对包封率的影响Fig.2 Effect of pH value of buffer solution onentrapment efficiency

图3 膜材比对包封率的影响Fig.3 Effect of membrane-material ratio onentrapment efficiency

2.2.4.3 药脂比对包封率的影响(图4)

图4 药脂比对包封率的影响Fig.4 Effect of drug-lipid ratio on entrapment efficiency

由图4可以看出，随着药脂比的增大即光修复酶加入量的增加，包封率呈下降趋势。这可能是因为，脂质体空间是有限的，载药量是一定的，当光修复酶加入量逐渐增加时，脂质膜无法包封所有的光修复酶，导致包封率降低。

2.2.4.4 油相与水相体积比对包封率的影响(图5)

图5 油相与水相体积比对包封率的影响Fig.5 Effect of volume ratio of oil phase to waterphase on entrapment efficiency

由图5可以看出，油相与水相体积比为4∶1时包封率最高。这是因为，当油相比例较小时，趋向于反相形成O/W型乳剂，不能很好形成W/O型乳剂，光修复酶不能进入脂质体中[19]，包封率相应较低；当水相比例较小时，光修复酶的浓度较大，而脂质体的容纳空间是有限的，增加水相的量反而易于造成药物渗漏，导致稳定性下降，包封率下降。

2.2.4.5 超声时间对包封率的影响(图6)

图6 超声时间对包封率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time on entrapment efficiency

由图6可以看出，包封率随着超声时间的延长先升高后降低，在超声时间为6 min时包封率最高。这是因为，超声时间过短，不能形成稳定的W/O型乳剂，光修复酶不能进入脂质体内部，包封效果不理想，包封率较低；超声时间过长，一方面包封率会下降，另一方面包封的光修复酶活性有所损失。

2.2.5 正交实验结果

正交实验的因素与水平见表2，结果与分析见表3。

由表3可知，各因素对包封率的影响大小依次为：药脂比>膜材比>超声时间>油相与水相体积比，最优组合为A2B1C2D2，即膜材比3∶1、药脂比1∶10、油相与水相体积比4∶1、超声时间6 min。

表2正交实验的因素与水平

Tab.2Factors and levels of orthogonal experiment

表3正交实验结果与分析

Tab.3Results and analysis of orthogonal experiment

在最优工艺条件下制备3批光修复酶脂质体，包封率平均值为44.13%，RSD为2.9%。表明，优化的制备工艺可靠，重复性好。

2.3 光修复酶脂质体的质量评价

2.3.1 形态

采用复染法进一步了解光修复酶脂质体的颗粒大小、形状，通过透射电镜观察其形貌，如图7所示。

由图7可以看出，在光修复酶脂质体的染色过程中，游离的光修复酶没有被分离开，对黑色背景造成了干扰。但还是可以看到光修复酶脂质体呈椭圆形，外观规则，表明药物被成功包封。

2.3.2 平均粒径及分布

脂质体药物的包封率和稳定性与其粒径大小及分布相关，当其粒径变小，粒度分布集中，有利于提高脂质体药物的稳定性。测定了3批光修复酶脂质体的粒径，其中一批的粒径分布如图8所示。

由图8可以看出，光修复酶脂质体的平均粒径为(490.9±2.3) nm，粒度分布均匀且集中。

2.3.3 Zeta电位及分布

Zeta电位是判断脂质体药物稳定性的重要指标，带电荷的离子可以防止脂质体离子间的相互作用，避免聚集和沉降。光修复酶脂质体Zeta电位分布如图9所示。

图7 光修复酶脂质体的扫描电镜和透射电镜照片Fig.7 SEM and TEM images of photolyase liposome

图8 光修复酶脂质体的粒径分布Fig.8 Particle size distribution of photolyase liposome

图9 光修复酶脂质体的Zeta电位分布Fig.9 Zeta potential distribution of photolyase liposome

由图9可以看出，光修复酶脂质体的Zeta电位在-30～-60 mV范围内，为-49.4 mV，表面带负电荷，体系比较稳定。

2.3.4 稳定性

光修复酶脂质体于4 ℃、20 ℃分别放置0 d、5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d后的包封率如图10所示。

图10 光修复酶脂质体在不同温度下的包封率曲线Fig.10 Entrapment efficiency curve of photolyaseliposome at different temperatures

由图10可以看出，在不同温度下，随着放置时间的延长，包封率均有所下降，但4 ℃下包封率下降较缓慢。这是因为，温度过低，光修复酶脂质体内外水相会形成冰晶，使双分子膜的渗透能力增强，破坏了膜的正常结构且光修复酶的活性也会受到影响；温度过高，脂质体的稳定性降低，光修复酶的活性同样会受到影响。故一般以4 ℃左右贮存脂质体混悬液较好[20]。

2.3.5 包封的光修复酶的活性

基于光修复酶脂质体可使嘧啶二聚体(265 nm处无吸收)解聚为单链核苷酸(265 nm处有吸收)，在紫外照射后破坏了DNA结构的光修复酶中加入光修复酶脂质体进行修复，评价包封的光修复酶的活性。

光修复酶紫外照射0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后的吸光度变化曲线及加入光修复酶脂质体修复0 min、5 min、10 min、15 min、20 min的吸光度变化曲线如图11所示。

由图11可以看出，加入光修复酶脂质体后，265 nm处吸光度逐渐增大，说明嘧啶二聚体解聚为单链核苷酸，DNA损伤得以修复。表明，包封的光修复酶可以使紫外照射下的嘧啶二聚体发生解聚，从而引起吸光度的增大，证明其发挥了作用。

3 结论

以包封率为评价指标，氯仿-乙醚混合溶剂(2∶3，体积比)为有机相，固态大豆卵磷脂和胆固醇为膜材，采用逆向蒸发法制备南极冰藻DNA光修复酶脂质体。通过单因素实验和正交实验确定了光修复酶脂质体的最佳制备工艺为：膜材比3∶1、药脂比1∶10、油相与水相体积比4∶1、超声时间6 min，所制得的光修复酶脂质体平均包封率为(44.13±2.90)%，平均粒径为(490.9±2.3) nm，Zeta电位在-30～-60 mV范围内，制剂的质量标准符合中国药典(2015版)要求。

图11 吸光度变化曲线Fig.11 Absorbance change curves

南极冰藻DNA光修复酶脂质体可用于抵抗紫外线辐射，具有良好的性能，为后期研究DNA光修复酶在日用防晒品中的应用提供了可靠的理论依据。

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PreparationofDNAPhotolyaseLiposomefromAntarcticIceMicroalgaeandItsQualityEvaluation

LI Ran1,2,CHEN Lu1,2,QI Juan1,JIN Qing1,MIAO Jin-lai2,3,4*

(1.QingdaoUniversityofScienceandTechnology,Qingdao266042,China;2.FirstInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Qingdao266061,China;3.QingdaoNationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology,Qingdao266235,China;4.QingdaoUniversity,Qingdao266071,China)

Using entrapment efficiency as an evaluation index,the mixed solvent of chloroform-ether(volume ratio 2∶3) as an organic phase,and solid soybean lecithin and cholesterol as membrane materials,we prepared DNA photolyase liposome from Antarctic ice microalgae by a reverse evaporation method.Through single-factor experiment and orthogonal experiment,we optimized preparation conditions as follows:the ratio of membrane to material was 3∶1,the ratio of drug to lipid was 1∶10,the volume ratio of oil phase to water phase was 4∶1,and the ultrasonic time was 6 min.Under above conditions,the average entrapment efficiency of photolyase liposome was (44.13±2.90)%.The prepared photolyase liposome was round or oval sphere,the average particle size was (490.9±2.3) nm,and Zeta potential was in the range of -30 mV to -60 mV.The quality standard of the preparation meets the requirements ofChinesePharmacopoeia(2015 edition),which provides a reliable theoretical basis for the application of DNA photolyase in the daily sun screen.

liposome;entrapment efficiency;DNA photolyase liposome from Antarctic ice microalgae;orthogonal experiment;quality evaluation

TQ461

A

1672-5425(2017)10-0025-07

国家自然科学基金项目(41576187)，中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2016Q10)，国家自然科学基金委员会-山东省人民政府海洋科学研究中心联合资助项目(U1606403)，国家海洋公益性行业科研专项(201405015)，山东省自主创新及成果转化专项(2014ZZCX06202)，青岛市创业创新领军人才计划项目(15-10-3-15-(44)-zch)，山东省重点研发计划(2016YYSP017，2016ZDJS06A03，2017GHY15112)

2017-04-22

李然(1991-)，女，山东滕州人，硕士研究生，研究方向：药物新剂型与新型给药系统，E-mail:m17806265315@163.com；通讯作者：缪锦来，研究员，E-mail:miaojinlai@fio.org.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.006

李然，陈璐，齐娟，等.南极冰藻DNA光修复酶脂质体的制备及其质量评价[J].化学与生物工程，2017，34(10)：25-31.