葡萄糖发酵生产ε-聚赖氨酸工艺优化

许永杰，张龙，潘龙，陈旭升，毛忠贵

(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡,214122)

葡萄糖发酵生产ε-聚赖氨酸工艺优化

许永杰，张龙，潘龙，陈旭升，毛忠贵*

(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡,214122)

为建立StreptomycesalbulusM-Z18以葡萄糖为碳源的ε-聚赖氨酸(ε-PL)高效发酵工艺，对葡萄糖和硫酸铵的流加方式和控制浓度、pH控制条件和溶氧控制水平进行了系统研究。研究结果表明，葡萄糖补料采用脉冲补料方式控制维持在10～30 g/L范围，氨氮补料采用脉冲补料方式维持在0.1～0.5 g/L范围，pH冲击时间为9 h、恢复pH为3.85，发酵中后期最佳溶氧水平为20%左右为最优ε-PL发酵工艺控制条件。经过8天补料-分批发酵，实现ε-PL产量达到47.13 g/L，菌体量为57.08 g/L，相比于优化前，ε-PL产量和菌体量分别提高了27.34%和19.61%。上述研究结果为ε-PL工业化生产奠定了基础。

ε-聚赖氨酸；链霉菌；补料方式；过程pH控制；溶氧水平

ε-聚赖氨酸(ε-poly-l-lysine，ε-PL)是由25～35个l-赖氨酸通过α-COOH和ε-NH2缩合形成的异形肽键连接而成。1997年，ε-PL首先由日本学者SHIMA和SAKAI从StreptomycesalbulusNBRC 14147的发酵液中发现[1-3]。基于ε-PL具有抑菌谱广、安全性高、效价高、热稳定性好和不影响食品风味等特点，被广泛应用于食品、医药、电子材料设计等领域[4-6]。目前，ε-PL最主要的用途是作为一种生物食品防腐剂。

ε-PL的生产主要采用链霉菌经液体好氧发酵的方式获得。目前，提高ε-PL产量的研究主要关注产生菌改造、营养条件优化和发酵过程调控。最早SHIMA和SAKAI利用1株野生菌S.albulus在含有甘油、(NH4)2SO4以及酵母粉的培养基中发酵48 h得到产量为0.3 g/L的ε-PL。此后，大量的研究者不断地对营养条件进行优化以期获得更高的产量。自ε-PL发现后，几乎所有的发酵生产都采用葡萄糖作为最适碳源。KAHAR等[7]根据S.albulusS410 在菌体生长和ε-PL合成过程中与pH的关系，建立了两阶段pH调控策略：第一阶段控制在pH 5.0以上用于菌体生长，第二阶段保持在pH 4.0左右用于ε-PL合成。基于该策略，利用5 L搅拌式生物反应器补料-分批培养S.albulusS410发酵生产ε-PL产量从5.7 g/L提高到48.3 g/L。而CHEN等[8]以及BANKA和SINGHAL[9]发现，甘油是S.albulusM-Z18和S.nourseiNRRL 5126合成ε-PL的最适碳源；他们分别采用RSM(Response Surface Methodology)和EVOP(Evolutionary Operation)的方式对显著影响ε-PL合成的营养组分进行优化，最终得到了最适的营养配比。CHEN[10]等在此基础上，采用葡萄糖和甘油作为混合碳源发酵生产ε-PL，经过174 h补料-分批发酵，最终的ε-PL产量达到35.14 g/L。REN[11]等以甘油为碳源，提出一种新的发酵策略即pH冲击发酵，经过8天补料-分批发酵使得ε-PL产量达到54.70 g/L。然而，根据郑根成[12]的研究发现，葡萄糖为碳源生产的ε-PL聚合度分布范围为20～34，主峰聚合度为30，较甘油获得的样品聚合度分布范围较集中且最大聚合度更高。进一步的样品抑菌实验，表明葡萄糖为碳源生产的ε-PL样品抑菌能力总体优于甘油生产的ε-PL样品。因此，葡萄糖成为ε-PL发酵的最优碳源。然而，葡萄糖相比于甘油发酵，其ε-PL产量明显低于甘油，所以有必要对葡萄糖发酵生产ε-PL工艺进行优化，以期达到工业化生产的要求。

本研究以葡萄糖作为碳源，pH控制方法采用pH冲击策略，研究了碳源和氮源流加方式和控制浓度对ε-PL发酵的影响，并对ε-PL发酵工艺中的过程pH控制策略及发酵中后期溶氧维持水平进行了优化，确定了最佳的葡萄糖发酵生产ε-PL工艺，为实现工业化生产奠定了基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 菌株

S.albulusM-Z18保藏于本实验室中。

1.1.2 种子培养基(g/L)

葡萄糖 50，酵母膏 5，(NH4)2SO410，KH2PO41.36，K2HPO40.8，MgSO4·7H2O 0.5， FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，pH 6.8。

1.1.3 发酵培养基(g/L)

葡萄糖 60，酵母膏 10，(NH4)2SO410，KH2PO44，MgSO4·7H2O 0.8，FeSO4·7H2O 0.05，pH 6.8。

1.2方法

1.2.1 种子培养方法

用无菌的接种环将1环孢子接种到装有80 mL 种子培养基的500 mL三角瓶中，将其置于摇床中30 ℃，200 r/min，培养24 h作为种子液。

1.2.2 发酵罐发酵方法

采用5 L搅拌式发酵罐进行发酵实验。装液量3.5 L，通气量0.5 vvm，搅拌转速200～900 r/min，接种量8%(v/v)。pH控制方法(pH冲击工艺)：通过外源流加氨水(12.5%，w/v)的方式，将初始pH调为pH 6.8，当pH自pH 6.8降至pH 5.0时开始自动控制pH稳定在5.0，维持8 h，随后不控制pH并维持12 h，冲击结束后迅速调至pH 3.95直至发酵结束。溶氧控制方法：在降为pH 4.0以前，溶氧(DO)控制在30%以上；当降为pH 4.0后，DO控制在20%以上。

1.2.3 葡萄糖流加方式

葡萄糖脉冲补料方法是当发酵液中葡萄糖质量浓度低于10 g/L时，开始流加900 g/L的葡萄糖溶液，使其质量浓度达到20 g/L(或者30 g/L、40 g/L)，以此循环直至144 h发酵结束。葡萄糖恒速补料方法是当发酵液中葡萄糖质量浓度低于10 g/L时，以恒定的补糖速率2.5 g/(L·h)[或者3 g/(L·h)、3.5 g/(L·h)]流加葡萄糖溶液，保持补糖速率不变至144 h发酵结束。葡萄糖变速补料方法是当发酵液中葡萄糖质量浓度低于10 g/L时，根据葡萄糖的消耗速率设定补料速率，维持葡萄糖质量浓度在10 g/L左右至144 h发酵结束。

1.2.4 硫酸铵流加方式

0.5 g/L氨氮质量浓度脉冲补料方法是当发酵液中氨氮质量浓度低于0.5 g/L时，开始流加375 g/L硫酸铵溶液使其达到0.5 g/L，以此循环直至192 h发酵结束。硫酸铵变速补料方法是当发酵液中氨氮质量浓度低于0.5 g/L时，根据氨氮的消耗速率设定补料速率，维持氨氮质量浓度在0.1～0.5 g/L至192 h发酵结束。

1.2.5 pH控制策略优化

将初始pH调为6.8，当pH自6.8降至5.0时开始自动控制pH， pH 5.0 维持8 h，随后不控制pH，保持9 h或12 h，冲击结束后将pH迅速调至3.85或3.75直至192 h发酵结束。

1.2.6 pH冲击发酵过程溶氧控制方法

pH在降至4.0之前通过调节转速将溶氧控制在30%左右，随后保持转速和通气量不变。在冲击结束后，当溶氧降至20%或10%，此时将溶氧和转速联动自动维持溶氧水平稳定在20%或10%，直至192 h发酵结束。

1.2.7 分析方法

菌体干重(DCW)测定方法：取10 mL发酵液，经过4 500×g离心10 min后，取出上清液；下层菌体沉淀用去离子水洗涤2次后，经预先称重的滤纸过滤后，105 ℃烘干至恒重后用于测量。ε-PL产量测定方法：取离心上清液后参照ITZHAKI的方法进行测定[13]。铵态氮浓度：采用奈斯勒试剂，通过比色法测定[14]。葡萄糖浓度的测定采用HPLC系统(U-3000,Dionex,CA)，配备示差检测器(Shodex RI-101,Tokyo,Japan)和离子交换柱(Aminex HPX-87H,300 mm×7.8 mm,Hercules,CA)。操作条件：柱温60℃，流动相5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min。

2 结果与分析

2.1葡萄糖流加方式对ε-PL补料-分批发酵的影响

在补料-分批发酵过程中，碳源的流加方式对发酵有着重要影响。一方面碳源匮乏会导致细胞无法获得营养而不能生长繁殖以及合成目标代谢产物；另一方面碳源浓度过高会限制菌体细胞的生长和过量代谢产生副产物[15]。因此有必要对葡萄糖流加方式进行优化。KAHAR等[7]在研究ε-PL发酵过程不同葡萄糖维持质量浓度(10、20、40 g/L)对发酵的影响时发现，当维持质量浓度在10 g/L左右时有利于发酵，所以脉冲补料的葡萄糖补料范围最低为10 g/L。在考察葡萄糖脉冲补料方式对发酵的影响时，为了缩短发酵时间，本实验采用144 h进行发酵并将脉冲糖浓度范围分别控制在10～20 g/L、10～30 g/L和10～40 g/L。3个脉冲质量浓度的葡萄糖补料起始时间几乎相同，但随着发酵的进行，不同的脉冲浓度对于发酵的影响是不同的。从表1可以看出，当脉冲质量浓度维持在合适水平是有利于发酵的，而脉冲浓度过高则严重影响菌体合成产物。10～30 g/L的脉冲质量浓度最有利于发酵，其产量最高。

表1 不同葡萄糖流加方式对ε-PL发酵的影响

在脉冲补料的基础上，选取2.5 g/(L·h)、3.0 g/(L·h)和3.5 g/(L·h)作为恒定补糖速率。在ε-PL发酵过程中，菌体在各阶段的葡萄糖消耗速率是不同的，因此如果出现葡萄糖补料过慢或者过快，体系中会出现糖消耗殆尽或者糖逐渐增加的过程。而葡萄糖缺乏或者糖浓度过高都不利于发酵产物的合成。当恒定补糖速率为2.5 g/(L·h)时发酵会出现长时间的缺糖状态，菌体活性受到极大影响，最终产量只有9.67 g/L。当恒定补糖速率进一步提高至3.0 g/(L·h)时，发酵缺糖时间相对缩短，对于发酵的不利影响也相对减弱，因此最终产量相比于2.5 g/(L·h)的补糖速率提高显著，产量达到21.08 g/L。而恒定补糖速率为3.5 g/(L·h)时，发酵过程中基本上不出现糖耗完的状态，能够满足发酵中对葡萄糖的需求，但是后期由于菌体活力的降低，葡萄糖消耗速率减慢，这就会出现葡萄糖的积累，也会对发酵造成不利影响，虽然产量进一步提高，但是也仅为24.89 g/L。

考虑到发酵过程中由于菌体活力的变化会造成葡萄糖的消耗速率改变，因此考察葡萄糖变速补料对发酵的影响，即根据葡萄糖的消耗速率不断改变其补料速率，而且避免出现葡萄糖耗尽现象，最终实现ε-PL发酵产量为28.67 g/L，菌体量达到50.50 g/L。综合以上所有结果发现，葡萄糖在10～30 g/L质量浓度范围的脉冲补料最有利于发酵，因此在接下来的优化实验中采取此种补料方式。

2.2氨氮维持浓度及硫酸铵流加方式对ε-PL补料-分批发酵的影响

在补料-分批发酵过程中，发酵至约72 h时氨氮质量浓度一般会降低至0.5 g/L以下。为了保证ε-PL持续快速的合成，通常采用流加高浓度硫酸铵溶液来保证氨氮维持在一定浓度范围，以保障菌体生长和产物合成需求。然而，在发酵中后期补加硫酸铵时，往往会发现溶氧水平会持续上升，这说明补加硫酸铵会对细胞活力产生影响，进而可能会影响菌体生长和产物合成。冯宁[16]等在研究氮源及其补料策略对L-缬氨酸发酵影响时，也发现高浓度的氮源会对菌体生长产生抑制作用。由此可以看出，发酵过程中维持适宜的氮源浓度可以提高发酵强度。从图1可以看出，当氨氮质量浓度范围维持在0.5～1 g/L时，发酵后期其溶氧水平远高于0.1～0.5 g/L的氨氮质量浓度范围，这说明前者菌体活力是低于后者的。最终表现为氨氮质量浓度为0.1～0.5 g/L范围时，发酵的菌体量和产量更高。造成这种发酵差异的原因是如果发酵过程中要保持较高的氨氮质量浓度范围即0.5～1 g/L，需要补加硫酸铵的次数增加，对菌体的生长造成较大伤害，直接表现是菌体提前进入衰亡期。同时过高的氨氮浓度是远远超过的菌体生长和产物合成的需要。因此0.1～0.5g/L的氨氮质量浓度范围更有利于发酵。

图1 氨氮质量浓度为0.5～1 g/L(A)和0.1～0.5 g/L(B)时的ε-PL补料-分批发酵过程参数Fig.1 Comparison of the parameters of pH shock fed-batch fermentation with 0.5～1 g/L(A) and 0.1～0.5 g/L(B) of ammonia nitrogen

当确定较低氨氮质量浓度范围0.1～0.5 g/L更有利于菌体的生长和产物的合成时，进一步优化了硫酸铵的补加方式。ε-PL发酵过程中氨氮的消耗速率存在如下规律：在产物快速合成期，氨氮消耗快，而在后期菌体活力衰退时，氨氮消耗变慢。如果硫酸铵的流加速率保持恒定，其设定值过高或过低，会造成氨氮过量积累或者匮乏，进而引起发酵的不稳定，因此不考虑采用恒速补料方式。由表2可知，两种补料方式最终的发酵结果相差不大，脉冲补料略优于变速补料，前者产量略高于后者。因此ε-PL发酵过程中氨氮质量浓度开始低于0.5 g/L时流加硫酸铵后应尽量保持氨氮质量浓度范围在0.1～0.5 g/L，既保证了氨氮不会匮乏，也避免了氨氮质量浓度过高带来的不利影响，在硫酸铵的补料方式上可以选择0.5 g/L氨氮质量浓度脉冲补料。

表2 硫酸铵流加方式对ε-PL发酵的影响

2.3pH控制策略对ε-PL补料-分批发酵的影响

利用pH冲击策略发酵生产ε-PL时，冲击时间和冲击后恢复pH是两个关键参数。因此，考察pH冲击时间和恢复pH对于发酵产量影响至关重要。从表3可以看出，pH冲击时间过短或过长对产物的合成均不利。当pH冲击时间过短时，菌体恢复至正常状态所需的时间更短，但后期菌体活力丧失的更快，所以pH冲击6 h时产量和菌体量均最低。而比较pH冲击9 h和冲击12 h发现，前者更有利于发酵。因此9 h为最佳冲击时间。

从发酵结果来看，改变冲击后恢复pH对发酵结果影响显著。当恢复pH3.95时，发酵后期菌体增长非常快，以至于最终菌体干重达到65.83 g/L；而当恢复pH为3.85时，后期菌体增长相比于pH 3.95较为缓慢，最终菌体干重为47.72g/L，但是这并没有影响产物的合成。显然菌体的大量增长会消耗更多的葡萄糖，因此降低恢复pH是有效控制菌体量的方法。然而，当继续降低恢复pH至3.75时，发现最终ε-PL产量大大降低，仅为30.2g/L。这表明此pH条件下不利于菌体的生长和合成，以至于影响了最终ε-PL产量。因此，pH3.85为最佳恢复pH值。

表3 pH控制策略对ε-PL补料-分批发酵的影响

2.4溶氧控制对ε-PL补料-分批发酵的影响

在pH冲击发酵过程中溶氧变化可以分为3个阶段：第一阶段是冲击前的菌体生长阶段，此阶段往往采取的策略是将溶氧控制在30%以上，以维持菌体的快速合成；第二阶段是pH冲击过程低pH带来的高溶氧状态，这一状态直接表明此时菌体处于较低的活力状态；第三阶段是菌体恢复之后的菌体生长和产物合成阶段。从发酵时间来看，前面两个阶段持续55 h，第三阶段持续约137 h。从产物合成来看，前两个阶段主要是用于菌体生长，只合成少量产物；而第三个阶段既会有菌体增长，也会伴随着大量产物的合成。因此，pH冲击结束后调节溶氧水平对于发酵结果有着重要影响。

由图2可以发现，pH冲击结束后溶氧水平对产物的合成以及菌体生长有显著影响，溶氧过高或者过低均不利于发酵。在对照实验中即不通过转速控制溶氧时，pH冲击结束后溶氧平均水平在30%，发酵8天后菌体量为47.72 g/L，产量达到37.26 g/L。当pH冲击结束，将溶氧水平控制在10%左右时，其发酵产量最低仅为35 g/L。从转速变化趋势来看，后期菌体活力呈现不断降低的趋势。而当溶氧水平控制在20%左右时，其菌体量和产量都达到最高，分别为44.8 g/L和57.8 g/L。因此，在pH冲击发酵后期，通过调节转速控制溶氧在20%左右时，能促进产物合成和菌体生长，比不控制溶氧或者溶氧较低时更有利于发酵。

图3 未优化前(A)与最优条件下(B)pH冲击补料-分批发酵Fig.3 The fermentation of pH shock fed-batch pH shock fed-batch before optimization(A)and under optimal conditions(B)of S.albulus M-Z18

2.5最优条件下ε-PL补料-分批发酵

在使用葡萄糖为碳源发酵时，通过对碳源和氮源流加方式的优化以及发酵工艺参数的优化，得出最佳发酵条件，需进一步探究优化前后发酵参数的变化情况。在最优条件下，发酵8天后ε-PL产量为47.13 g/L，菌体量为57.08 g/L。相比于以葡萄糖为碳源未优化前发酵，产量提高了27.34%，菌体量增长了19.61%。这说明，通过对碳源和氮源流加方式及发酵工艺的优化能够显著的促进菌体增长和ε-PL合成。

3 结论

本研究以葡萄糖为发酵碳源，在此基础上对葡萄糖的流加方式，氨氮质量浓度维持范围和流加方式，及发酵工艺参数优化进行优化，能使得ε-PL发酵产量相比于未优化时有了极大的提高。最优条件是葡萄糖补料方式为10～30 g/L质量浓度范围的脉冲补料，氨氮补料方式是0.5g/L氨氮质量浓度脉冲补料，并保持氨氮质量浓度范围在0.1～0.5 g/L。而pH冲击发酵最佳pH冲击时间为9 h，最佳恢复pH为3.85，pH冲击结束后最佳溶氧水平为20%。在最优条件下进行补料分批发酵实验，8天后产量为47.13 g/L，菌体量为57.08 g/L，相比于未优化前发酵，产量提高了27.34%，菌体量增长了19.61%。这为进一步ε-PL工业化生产奠定了基础。

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Optimizationofε-poly-L-lysineproductionwithglucoseascarbonsourcebyStreptomycesalbulusM-Z18

XU Yong-jie,ZHANG Long,PAN Long,CHEN Xu-sheng,MAO Zhong-gui*

(School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

To develop an efficient ε-poly-L-lysine(ε-PL)fermentation process ofStreptomycesalbulusM-Z18 with glucose as carbon source, feeding approaches and concentrations of glucose and ammonium sulfate, pH control strategy and the level of dissolved oxygen were investigated systematically in this study. The optimal conditions of ε-PL fermentation were established as following: the concentrations of glucose and ammonia nitrogen were maintained in the range of 10-30 g/L and 0.1-0.5 g/L by pulse feeding mode, respectively; the pH shock time was lasted 9 h and the recovery pH was set to 3.85; and the optimal dissolved oxygen level in the middle and later stage of fermentation was about 20%. After 8 days of fed-batch fermentation, the ε-PL production and biomass reached 47.13 g/L and 57.08 g/L, respectively. Compared with those of the non-optimized fermentation, the ε-PL production was increased by 27.34% and the biomass was enhanced by 19.61%. Obviously, the results of this study laid the foundation for the industrial production of ε-PL.

ε-poly-L-lysine;Streptomyces;feeding approaches;process pH control;dissolved oxygen level

硕士研究生(毛忠贵教授为通讯作者，E-mail:maozg@jiangnan.edu.cn)。

江苏省产学研合作前瞻性联合研究项目 (BY2016022-25)

2017-02-16，改回日期：2017-03-15

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014073