hBMP2修饰的β-TCP/胶原支架对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响

赵刚 曾娟 李德超 丁元圣 朱旭佳 宋天喜

hBMP2修饰的β-TCP/胶原支架对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响

赵刚 曾娟 李德超 丁元圣 朱旭佳 宋天喜

目的构建含hBMP2(human bone morphogenetic proteins 2)质粒DNA的β-TCP/胶原(β-tricalcium phosphate/collagen)支架材料，并研究其对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响。方法制备纳米级多孔β-TCP/胶原支架并负载含hBMP2目的DNA基因及对照质粒形成基因修饰的支架材料。建立MC3T3-E1细胞株与复合支架的体外培养体系。将其分为支架组hBMP2组(Z)对照质粒组(Z0)，平皿hBMP2组(M)和对照质粒组(M0)。复合培养后取样通过扫描电镜观察支架表面形态，成骨诱导1、3、7、14 d检测不同浓度BMP2支架组和非支架组细胞碱性磷酸酶(ALP)的活性，并在成骨诱导的不同时间点采用实时荧光定量PCR的方法检测 Runx2、OCN、ALP、OPN等成骨相关标志基因表达。检测结果进行统计学分析。结果含hBMP2为目的基因的质粒DNA修饰纳米β-TCP/I型胶原溶液复合材料表面呈多孔样结构；支架组和平皿组中加入hBMP2质粒DNA都能提高ALP的活性以及成骨相关标志基因的表达；支架组对MC3T3-E1细胞成骨促进能力优于平皿组。结论负载hBMP2基因修饰的β-TCP/胶原支架材料具有良好的骨诱导性。

BMP2； β-TCP/胶原； 成骨能力； 骨缺损

骨缺损是一种常见、多发又治疗相当复杂的先天性、发育性及后天疾患。组织工程支架材料在骨缺损修复中被广泛应用，β磷酸三钙(β-tricalcium phosphate, β-TCP)是最重要的支架材料，它具有良好的生物相容性，但其生物响应性(即受植区组织)对其反应性,远远不如自体骨组织，因此解决此类问题成为国内外的研究热点。越来越多的研究开始使用包裹生物活性因子[1]的缓释材料(如纳米微囊)，或者以生化技术搭载生物活性因子相关基因载体并由种子细胞吞噬后，可大量表达生物活性因子的材料。这种技术虽然已经非常先进，但仍然需要不断探索。本实验将具有骨传导性能的β-TCP/胶原支架与具有成骨活性的因子BMP2载体进行复合，形成的复合支架材料以期其具备更优越的骨传导性和骨诱导性。

1 材料与方法

1.1 实验设计与材料分组

2015-03～2016-01于佳木斯大学基础实验室完成；实验设计：体外细胞观察性实验；实验材料分组：支架组(Z)：根据支架上复合hBMP2质粒的量分为2 组：Z0组(支架含14 μg对照质粒)和Z14组(支架含14 μg hBMP2质粒)。平皿组(M)：根据转染时在12 孔板中所加hBMP2质粒的量分为2 组：M0组(平皿加1 μg对照质粒)和M1(平皿加1 μg hBMP2质粒)。

主要实验仪器：层流超声工作台、电热恒温培养箱(上海博迅实业有限公司)，超低温冰箱(Thermo，美国)，扫描电镜(岛津，SSX-550，日本)、倒置显微镜(Olympus BX5，日本)，辅助电动移液枪、离心管、微量移液器(Brand，德国)，高速Megafuge离心机、NanoDrop 2000c微量分光光度计、涡旋离心机(Thermo Scientific，美国)，LightCycler@480 实时荧光定量 PCR 仪(Roche，瑞士)，PCR仪(Biorad，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 合成带有hBMP2基因的质粒DNA hBMP2为目的基因的质粒DNA购于大连宝生物工程有限公司，按参考文献[2]制备出含hBMP2目的基因的真核表达载体，以购自ATCC的hBMP2基因为模板进行PCR扩增，hBMP2基因的序列号为：NM-001200.2，ID：650，PCR的产物通过分离纯化后经Xba I、Hind Ⅲ双酶切，插入相同双酶切的pcDNA3.1(-)表达载体，再经测序及酶切鉴定后大量扩增并纯化，制备液态hBMP2/pcDNA3.1(-)，其浓度为3 μg/μl，-20 ℃保存备用。

1.2.2 负载hBMP2为目的基因质粒DNA修饰纳米β-TCP/胶原溶液复合材料 复合材料购于北京奥精医药科技有限公司，纳米级复合材料按参考文献[3]制备：将已经制备好的含hBMP2目的基因液体的质粒DNA滴加至支架材料，然后经过低温冻干处理后，制备成含不同质粒浓度的支架材料，并切割成5 mm×5 mm×2 mm的小长方体，-20 ℃保存备用。

1.2.3 MC3T3-E1细胞培养 MC3T3-E1细胞购于北京协和细胞资源中心。经过复苏、培养、传代。

1.2.4 材料与细胞复合培养 细胞接种：所有支架材料经过高压蒸汽灭菌，再经紫外线光照射3 h，从而达到分组材料灭菌的目的。将支架材料放入24 孔板中，再加入1 ml含10%FBS的α-MEM预先润湿过夜。采用负压将支架材料上的液体抽干，将5×104个小鼠前成骨MC3T3-E1细胞细胞滴加到支架上，并在37 ℃，5%CO2浓度的孵箱中孵育3 h，之后加1 ml完全培养基。平皿培养是直接在24 孔板中每孔接种5×104个细胞。

细胞转染：待24 孔中细胞达到70%汇合率时，进行BMP2转染。含BMP2的质粒由大连宝生物工程有限公司合成，转染前先将完成培养基换成无血清α-MEM。分别在2 个1.5 ml EP管中加入50 μl α-MEM，其中一管中加入2.4 μl脂质体(汉恒生物，中国)，另一管中加入1 μg含BMP2的质粒DNA或对照质粒，混匀后孵育5 min，将脂质体滴加到质粒DNA中孵育20 min后，均匀滴加到12 孔内。支架组只加脂质体。6 h后换为正常的完全培养基。

1.3 检测方法与指标

1.3.1 形态学观察 体外细胞预处理后，扫描电镜、光镜进行细胞形态学观察。

1.3.2 碱性磷酸酶活性(ALP)检测 配置成骨诱导液，将平皿与支架上成骨诱导1、3、7、14 d的细胞用预冷的PBS洗2 遍，胰酶消化后离心去上清，加入100 μl 0.1% triton X-100(Amresco,USA)，打散细胞后4 ℃放置6 h离心取上清。根据碱性磷酸酶测试盒说明书(南京建成，中国)对ALP活性进行测定。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测 各组细胞在第1、3、7、14天4 个时间点用TRIzol进行裂解细胞，使用氯仿、异丙醇等提取mRNA，1 μg mRNA逆转录为cDNA后，采用LightCycler@480实时荧光定量PCR仪对细胞成骨相关基因Runx2、OCN、ALP、OPN的表达进行检测。基因引物见表 1。

表 1 RT-PCR引物序列

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 形态学观察结果

2.1.1 支架电镜图 含hBMP2质粒DNA修饰的纳米级β-磷酸三钙/I型胶原复合材料的扫描电镜下观察形态(图 1)。显示复合材料的表面上有大量大小不一的孔隙。从而判断复合材料中的微孔都是相互连通的。连通的微孔能够为成骨细胞在材料内的活动提供有利通道。

2.1.2 hBMP2转染效率 MC3T3-E1细胞中转染GFP对照质粒的细胞显示有绿色荧光超过90%(图 2A、2B)，说明我们成功将外源基因转染至细胞中。同时我们对转染了hBMP2的MC3T3-E1细胞中BMP2的mRNA表达进行Real-time PCR检测发现BMP2的表达升高(图 2C)。

图 1 支架电镜图

2.2 碱性磷酸酶ALP活性检测结果

将MC3T3-E1细胞接种在平皿和支架材料的表面，在诱导后的1、3、7、14 d对成骨细胞中ALP的活性进行检测，发现在成骨诱导过程中平皿组和支架组ALP表达均呈现升高的趋势，在成骨细胞接种早期(1、3 d)，平皿组和支架组ALP的活性较低，在各组间差异不是很显著；随着诱导时间的增加，接种于支架材料的成骨细胞的ALP活性明显且高于平皿组；平皿培养的细胞中转染hBMP2或复合hBMP2质粒的支架组均表现出较高的ALP活性(图 3)。

2.3 实时荧光定量PCR检测细胞成骨相关基因表达结果

MC3T3-E1细胞在成骨诱导1、3、7、14 d的过程中, 成骨相关标志基因Runx2，OCN，ALP，OPN表达均呈现升高的趋势(图 4)，其中支架组成骨相关标志基因表达升高较平皿组明显；成骨诱导中后期，复合hBMP2质粒的支架组成骨标志基因表达明显高于对照支架组。

图 3 4 组MC3T3-E1细胞转染后不同时间点ALP的活性

Fig 3 ALP activity of MC3T3-E1 cells at different time points after transfection

3 讨 论

近年来人们逐渐认识到细胞载体的重要性并开始不断探索，Green[4]1977 年就预言有可能在新型生物相容性材料上种植细胞并形成可以被移植的成骨新组织。临床上大量试验研究充分证实BMP2具有优良的骨形成诱导能力[5-6]。但是也有研究指出BMP2在体内的半衰期比较短，容易被蛋白酶降解，发挥诱导成骨作用能力低[7]。本课题组体外实验将编码具备hBMP2基因的质粒DNA承载到纳米级多孔β-TCP/胶原支架材料上，检测其成骨活性能力。扫描电镜、光镜下显示转染GFP对照质粒的细胞有超过90%的细胞显示有绿色荧光(图 2A、2B)，说明我们已成功将外源基因转染至细胞中。RT-PCR检测发现转染了hBMP2的细胞中hBMP2的表达升高。这表明β-TCP/胶原支架材料具有优良的骨传导性，以实现临床上的骨组织的爬行替代过程。ALP活性检测结果显示成骨诱导过程中ALP活性呈现逐渐增高的趋势，第7天开始接种于支架材料的成骨细胞分泌的ALP开始增加明显且高于平皿组，并且在平皿培养的细胞中转染hBMP2可促进ALP活性的表达。进一步证实hBMP2基因修饰材料良好的骨诱导活性。

图 4 转染后不同时间点4 组MC3T3-E1 细胞中成骨相关标志基因的表达

质粒载体临床上有较高安全性，广泛的应用于基因工程中[8]。在成骨诱导分化过程中，ALP是成骨细胞分化的早期标志[9]。本课题组ALP活性和RT-PCR检测结果分析中发现hBMP2在体外实验MC3T3-E1细胞中得到了较好的表达，并且检测因子在14d时hBMP2的表达更加增强，但是对照组单纯DNA支架组中的BMP2的表达相对较弱。从而说明了平皿和支架组均能促进成骨细胞的成骨活性有良好的生物相容性，然而实验结果显示支架组的成骨活性要优于平皿组。Keeney[10]研究也发现磷酸钙/胶原复合支架材料可以作为裸DNA的高效载体,与本实验的研究结果一致。

BMP2是一种具有多功能作用的蛋白，在骨形成过程中的作用已被广泛研究[11]。BMP2可促进成骨细胞分化成熟，加速骨缺损的修复。其中BMP2用来治疗骨缺损取得良好疗效[12]。本实验构建hBMP2真核表达载体并转染入MC3T3-E1细胞，β-TCP可促进细胞分化，分化后的细胞具有成骨细胞的形态特点和生物学行为。β-TCP具有很好的诱导MC3T3-E1分化成骨的能力，经ALP及RT-PCR鉴定，结果表明MC3T3-E1细胞能够成功表达目的蛋白。郝伟等[13]基于脂肪干细胞I型胶原凝胶PLGA-β-TCP支架的新型仿生骨组织工程也已经证明复合支架材料的生物性能明显优于材料复合培养之前分别对成骨细胞成骨能力的影响。本课题组实验结果证明含hBMP2为目的基因的质粒DNA修饰的纳米级β-TCP/胶原溶液的复合材料对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响优于3 种材料分别对细胞产生的影响。

综上所述，负载BMP2基因修饰的β-TCP/胶原支架材料具有良好的生物相容性、优良的骨诱导性和骨传导性，具有良好的临床应用前景，是一种理想的骨缺损修复材料。可以应用于口腔种植修复、口腔颌面外科及其与口腔正畸联合修复骨缺损治疗中。

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Theeffectsofβtricalciumphosphate/collagenscaffoldloadedwithhumanbonemorphogeneticprotein2plasmidontheosteogenesisabilityofMC3T3-E1cells

ZHAOGang,ZENGJuan,LIDechao,DINGYuansheng,ZHUXujia,SONGTianxi.

154007,JiamusiUniversitySchoolofStomatology,China

Objective: To study the effects of beta tricalcium phosphate(β-TCP)/collagen scaffold loaded with human bone morphogenetic protein 2(hBMP2) plasmid on the osteogenesis ability of MC3T3-E1 cells.MethodshBMP2 DNA plasmid-modified β-TCP/collagen scaffold and the naked plasmid(control) were constructed. MC3T3-E1 cells were respectivelyinvitrocultured onto the β-TCP/collagen scaffold with hBMP2(Z) and with control plasmid(Z0),on peace dish with the saffold and hBMP2(M) and with the control plasmid(M0). The surface morphology of the samples was observed by SEM. Osteogenesis of the cells was examined by alkaline phosphatase activity(ALP) test, real-time fluorescent quantitative PCR for the detection of Runx2, OCN, ALP and OPN mRNA expression. Data were statistically analyzed.ResultsThe composite sample surface of plasmid DNA containing hBMP2 modified β-TCP/collagen was porous; group Z and M showed highter ALP activity and higher mRNA expression of Runx2, OCN, ALP and OPN than group Z0 and M0; so did group Z than group M.ConclusionPorous β-TCP/collagen scaffold loaded with BMP2 DNA is potential for osteoinduction.

BMP2；β-TCP/collagen；Osteogeneticability；Bonedefect

黑龙江省自然科学基金(编号： H201487)

154007， 佳木斯大学口腔医学院正畸科

赵刚 E-mail： 13504545575@126.com

R329.24

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.006

(收稿： 2017-01-28 修回： 2017-03-07)