Ag纳米立方共振传感器的热组装及应用

卢伟伟，黄青玲，张　军

(河南科技大学 化工与制药学院，河南 洛阳 471023)



Ag纳米立方共振传感器的热组装及应用

卢伟伟，黄青玲，张军

(河南科技大学 化工与制药学院，河南 洛阳 471023)

采用热驱动组装的方法，制备了限域表面等离子体共振传感膜。首先，以聚乙烯吡咯烷酮为结构导向剂和稳定剂制备了Ag纳米立方。然后，利用两亲性分子2-二乙胺基乙硫醇的亲疏水性随温度变化的性质，通过温度调控实现了Ag纳米立方在玻璃基体上的二维组装。以Ag纳米立方表面的聚乙烯吡咯烷酮为偶联剂，采用经典Stober法在二维组装膜表面包覆了SiO2，从而提高了传感膜的稳定性以及后续功能化的可行性。最后，将Ni2+/次氮基三乙酸体系引入表面等离子体共振传感器表面，实现了生物素的固载和溶液中链霉亲和素的高灵敏度传感检测。

Ag纳米立方；自组装；表面等离子体共振；传感

0　引言

近年来，由于限域表面等离子体共振(localized surface plasmon resonance,LSPR)传感器具有高选择性、高灵敏度和低检测限，并可以在普通的紫外-可见分光光度计上进行检测等特点，可以发展成为低成本、便携式的实时监测设备[1]，从而得到了广泛的关注并进行了深入的研究。

要制备LSPR传感器，首先要解决的问题是如何将金属纳米粒子组装或固定到透明基体上，形成稳定的二维膜。目前，二维膜的制备方法分为物理方法和化学方法两大类。物理方法通常采用不同的刻蚀技术，如电子束刻蚀技术[2]、聚焦离子束刻蚀技术[3]和激光干涉光刻技术[4]等，但这些技术所需设备复杂，制备过程繁琐，且可以形成的二维膜面积非常有限，导致物理方法效率低并且成本过高。近年来，化学组装方法如Langmuir-Blodgett技术[5]、分子调控组装技术[6]和界面自组装技术[7]等逐渐发展起来。虽然化学方法相比于物理方法，其对二维组装膜上纳米粒子的尺寸、形貌、晶型、粒子间距和膜面积的大小等方面的控制要好，但同样存在所需设备复杂(如Langmuir-Blodgett技术)、表面改性繁琐(如分子调控组装技术)和难以调控粒子间距(如界面自组装技术)等问题，很难成为一种普遍有效的组装方法。因此，发展LSPR组装技术仍然是一项具有挑战性的工作。

由于生物素与亲和素间存在强亲和作用，且两者的结合稳定性好、专一性强，不受试剂浓度、pH值以及蛋白变性试剂等影响。生物素与亲和素既可以偶联抗体等大分子生物活性物质，又可被酶等多种材料所标记，因此，可以构建一个多层次信号放大系统，用于微量抗原、抗体和受体的定量检测、定性检测及定位观察研究，也可制成亲和介质用于上述反应体系中反应物的分离和纯化。因此，找到一种简便方法研究生物素与亲和素间的相互识别和检测变得非常重要。

本文提出了一种简单的热组装方法，利用两亲性分子2-二乙胺基乙硫醇(2-diethylaminoethanethiol，DEAET)的亲疏水性随温度变化的性质，通过改变温度实现了Ag纳米立方在玻璃基体上的二维组装，并通过扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)、透射电镜(transmission electron microscope,TEM)、紫外-可见(ultraviolet-visible,UV-vis)分光光度等方法对纳米粒子和二维膜的结构进行了表征。最后，以生物素与链霉亲和素为传感体系，研究了所制备的LSPR传感器在生物检测识别中的应用。

1　试验

1.1Ag纳米立方的制备及其热驱动组装

Ag纳米立方的制备采用多元醇方法[8]。具体的热驱动组装试验过程如下：将10 mL Ag纳米立方水溶液放入带旋塞的玻璃样品瓶(φ20 mm×70 mm)中，加入4 mL的甲苯，形成甲苯-水两相体系；加入一定量的DEAET，充分搅拌。将羟基化处理过的玻璃片置于此反应容器中，通过循环水浴调节反应温度至60 ℃，1 h后取出玻璃片，用二甲苯和乙醇多次冲洗，再用氮气吹干，备用。此组装膜样品标记为Ag/Glass。

1.2LSPR传感界面的形成

为了提高Ag纳米立方组装膜的稳定性，采用经典的Stober法[9]对Ag/Glass进行硅化包覆。具体步骤如下：将制备的Ag/Glass样品置于15 mL含有5 mL氨水(体积分数为4.2%)和20 μL 正硅酸乙酯的乙醇混合溶液中，25 ℃搅拌反应8 h后取出，并用大量乙醇冲洗，氮气吹干，备用。SiO2包覆后的样品标记为SiO2/Ag/Glass。

引入螯合剂次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid，NTA)，具体步骤如下：首先，将SiO2/Ag/ Glass置于15 mL、体积分数为3%的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-glycidyloxypropyl trimethoxysilane，GPTES)的乙醇溶液中，反应8 h。然后，将样品置于含有0.01 mol/L的Nα,Nα-二羧甲基-L-赖氨酸(Nα,Nα-bis(carboxymethyl)-L-lysine)的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH=8.0)中，反应4 h后，用大量的高纯水冲洗，并用氮气吹干。最后，将样品置于浓度为100 mmol/L的NiCl2溶液中，反应 2 h 后，用高纯水淋洗除去未反应的Ni2+离子。引入NTA和Ni2+后的样品标记为Ni2+-NTA/SiO2/Ag/Glass。

将所制备的Ni2+-NTA/SiO2/Ag/Glass样品置于his6标记的生物素浓度为500 μg/mL的PBS缓冲溶液(pH=7.4)，2 h后，用PBS缓冲溶液淋洗，4 ℃保存于PBS缓冲液中备用。his6标记生物素的样品标记为his6-biotin/Ni2+-NTA/SiO2/Ag/Glass。

1.3传感检测

为了测定SiO2/Ag/Glass的折射率灵敏度，所用的纯试剂及其相应折射率n分别为：n水= 1.333，n丁醇=1.397，n乙二醇=1.432，n二甲基亚砜=1.478。

以生物素和链霉亲和素相互作用为模型，表征所制备的LSPR传感器的性能。将his6-biotin/Ni2+-NTA/SiO2/Ag/Glass分别置于一定浓度(0.01～1 000 nmol/L)的链霉亲和素待分析溶液中2 h，并用PBS缓冲液冲洗以除去未被键合的链霉亲和素，接着用氮气将样品干燥，最后将样品放置于UV-vis样品台上测定其LSPR光谱。

2　结果与讨论

2.1Ag纳米立方的制备及组装膜的结构表征

采用多元醇方法所制备的Ag纳米立方的SEM和TEM表征结果如图1所示。由图1可以看出:所制备的Ag纳米粒子具有立方形貌，且其边长为45 nm左右。本文利用DEAET的亲水性和疏水性随温度变化性质，采用热驱动组装方法成功地将所制备的Ag纳米立方粒子组装到了透明玻璃基体上以构建LSPR传感膜。

为了考察DEAET在二维Ag纳米立方膜组装过程中的重要作用，在其他条件不变的情况下，本文选用同样含有巯基(-SH)官能团的巯基乙酸、氨基乙硫醇和苯硫酚代替DEAET做了Ag纳米立方粒子的组装试验。试验结果表明：在相同的试验条件下，这些分子的加入不能驱动Ag纳米立方组装膜的形成。这些对照试验说明在形成二维Ag纳米立方膜的过程中，DEAET分子的独特结构起着重要作用。为了更进一步考察DEAET的作用，对在不同量的DEAET作用下形成的薄膜进行了UV-vis表征，结果如图2所示。从图2中可以看出：随着DEAET量的增加，位于400～500 nm的LSPR吸收峰的吸光度逐渐增大。因为纳米粒子LSPR吸收峰的吸光度和Ag纳米立方的数密度紧密相关，因此，LSPR吸收峰吸光度的增大说明随着DEAET量的增多，更多的Ag纳米立方被担载到玻璃基体上。

图2　不同DEAET加入量所制备的二维Ag纳米立方膜的UV-vis光谱

为了进一步证实DEAET的加入量对组装膜结构的影响，本文使用硝酸将玻璃基体上的Ag纳米粒子溶解后，采用电感耦合等离子体发射光谱(inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP-OES)测定不同基体上Ag的担载量，然后计算出其相应的总担载量、质量密度、数密度和平均担载层数，结果见表1。需要说明的是，计算出的Ag纳米立方的担载层数并非为整数，这说明Ag纳米立方在玻璃片上有一定的不均匀分布和团聚现象。对比图2和表1的试验数据可知：吸光度的大小和担载层数有着直接的对应关系，即担载层数越大，其吸光度也越大。这也进一步证实了DEAET的加入量对薄膜的形成及其结构具有重要的影响。

表1　DEAET所制备样品表面Ag纳米立方的总担载量、质量密度、数密度和平均担载层数

这种热驱动组装现象可以从DEAET的两亲分子结构上来进行解释。DEAET分子式为(CH3CH2)2NCH2CH2SH，此分子不仅含有疏水性的乙基，而且含有亲水性的胺基，更为重要的是该物质的亲水性和疏水性可由温度控制[10]。当温度升高时，其亲水性增强而与极性溶剂(如水)的互溶度增大；当温度降低时，其疏水性增强而与非极性溶剂(如甲苯)的互溶度增大。当加入DEAET后，由于DEAET分子中巯基(-SH)与金属原子之间强的相互作用，从而取代了部分纳米粒子表面起结构导向剂和稳定剂作用的聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)分子。当反应系统温度升高时，在DEAET亲水性增强的作用下，将驱使Ag纳米粒子从甲苯-水界面处向水相中转移；当Ag纳米粒子在水相中遇到羟基化玻璃基体时，纳米粒子表面的PVP分子由于和玻璃表面羟基(-OH)之间较强的氢键作用，而驱使纳米粒子担载于玻璃片上。图3为不同DEAET加入量下，所制备的二维Ag纳米立方膜的SEM照片。由图3可看出：在本试验的条件下，当DEAET加入量为3 μL时形成的二维Ag纳米立方膜的分布最均匀(如图3c所示)，因此，本试验采用DEAET加入量为3 μL时形成的二维Ag纳米立方膜作为传感基体。

图3　不同DEAET加入量所制备的二维Ag纳米立方膜的SEM照片

2.2二维传感膜灵敏度的测定

为了提高Ag纳米立方组装膜的稳定性，本文采用经典的Stober法对Ag/Glass进行硅化包覆。包覆SiO2并不需要加入额外的偶联剂，这主要是因为本文所制备的Ag/Glass二维膜上Ag纳米粒子表面存在PVP，而PVP本身就是被广泛使用的偶联剂。SiO2的包覆主要有两个方面的作用：一方面，可以隔离二维膜中Ag纳米粒子和待检测溶液的直接接触，从而避免它们之间由于相互作用而导致传感膜的结构和形貌发生变化；另一方面，由于成熟的硅表面处理技术的存在，SiO2的包覆为在二维膜表面进一步固载功能性物质提供了便利。

为了评价样品的传感性能，测定SiO2/Ag/Glass样品的吸光度随外界溶剂折射率的变化，结果如图4所示。从图4中可以看出：LSPR吸收峰随着外界溶剂折射率的增大而发生红移，同时LSPR吸收峰的吸光度也随之增大。将图4中波长和吸光度数据列于图5中，可以分别得到波长和吸光度随折射率的变化规律。

图4　SiO2/Ag/Glass样品在不同溶剂中的吸光度

图5　SiO2/Ag/Glass样品波长和吸光度随折射率的变化规律

经直线拟合后，可以计算出Ag纳米立方构建的二维SiO2/Ag/Glass样品的折射率灵敏度：当以波长表示时，为103 nm/RIU(其中，RIU为单位折射率)；而当以吸光度表示时，为0.834/RIU。从图5中可以看出：这两种灵敏度表现形式误差范围差别不大，但以波长表示的折射率灵敏度要远远大于以吸光度表示的折射率灵敏度，因此，本文在后面的传感研究中选取LSPR吸收峰波长的变化作为传感信号。

图6　LSPR传感器的UV-vis峰波长的链霉亲和素浓度响应曲线

2.3LSPR传感器在生物检测识别中的应用

Ni2+/NTA体系和组氨酸标签(histidine-tag，简称his-tag)之间的相互作用，已经被广泛地应用在固定蛋白质等生物分子的研究中，本文利用这种方法将his6标记的生物素嫁接到Ni2+-NTA/SiO2/Ag/Glass表面，进而利用生物素和链霉亲和素之间的强相互作用，实现溶液中链霉亲和素的检测。检测过程中，由于生物素和链霉亲和素的结合，造成二维传感膜表面处介电常数的变化，这将造成传感膜LSPR吸光峰的波长随之发生变化。所制备的二维纳米立方Ag传感器在不同链霉亲和素浓度下的UV-vis峰波长的变化如图6所示。检测限定义为当吸光度变化等于仪器噪声的3倍时所对应的检测物的浓度[11]。从图6中可以求出此传感膜对链霉亲和素的检测限为5.6 nmol/L。虽然和文献[11]中报道的同类相互作用的检测中的最低检测限(10-3nmol/L)相比较，本文所制备的二维传感膜的检测限明显偏高，但和其他检测器相比，其优势在于相对简单的传感膜组装制备方法和高稳定性。

3　结论

本文利用热驱动法实现在玻璃基体上Ag纳米立方结构的二维可控构筑，并且以纳米粒子自身的结构导向剂和稳定剂PVP作为偶联剂，利用简单易行的经典Stober法实现了组装膜的SiO2包覆。最后，通过Ni2+/ NTA体系将生物素固载到传感器表面，实现了对链霉亲和素的检测，其检测限达到5.6 nmol/L。由于PVP作为结构导向剂广泛应用于各种金属纳米材料的制备中，因此，本文提出的热组装方法可拓展到这些纳米材料二维膜的构建中。

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国家自然科学基金项目(21303040,21576073);河南科技大学青年学术带头人基金项目(13490001);洛阳市矿产资源化工重点实验室建设基金项目(1003016A)

卢伟伟(1980-),男,河南洛阳人,副教授,博士,主要从事功能纳米材料等方面的研究.

2015-11-30

1672-6871(2017)01-0093-05

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.01.019

TB34

A