HIV感染无症状者外周血中HIV特异性T细胞及其亚群表达CD160情况的研究

黄磊 涂波 金磊 李丰衣 张昕 王淑青 张政 聂为民

100039 北京，解放军第三○二医院感染性疾病诊疗与研究中心(黄磊、涂波、金磊、李丰衣、王淑青、聂为民)，临床研究医学转化中心(张政)

·论著·

HIV感染无症状者外周血中HIV特异性T细胞及其亚群表达CD160情况的研究

黄磊 涂波 金磊 李丰衣 张昕 王淑青 张政 聂为民

100039 北京，解放军第三○二医院感染性疾病诊疗与研究中心(黄磊、涂波、金磊、李丰衣、王淑青、聂为民)，临床研究医学转化中心(张政)

目的探讨HIV感染无症状者外周血中CD160在HIV特异性T细胞及其各亚群中的表达情况。方法采集2014年6月至2015年11月于解放军第302医院就诊的43例未经抗病毒治疗的HIV感染无症状者和18例健康者的外周血，分离外周血单个核细胞，用免疫荧光染色法标记CD160后，以流式细胞仪检测其在HIV特异性T细胞及其各亚群(Tn、Tcm、Tem和Teff)细胞上的表达情况。结果HIV感染无症状者外周血中，CD160在总体HIV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞中表达的频数和MFI均较健康对照组高(P<0.01)；HIV特异性CD4+T细胞的各亚群中，CD160在CD4+Tn细胞中MFI，CD4+Teff细胞中频数和MFI显著升高(P<0.01)；HIV特异性CD8+T细胞的各亚群中，CD8+Tn细胞、CD8+Tcm细胞及CD8+Tem细胞表达CD160的频数和MFI均显著升高(P<0.01)。结论慢性HIV感染可导致HIV特异性T细胞及其不同亚群中CD160高表达，引起细胞免疫功能紊乱，可能进而损伤了对HIV病毒的控制能力。

病毒特异性T细胞在控制病毒感染的过程中发挥着关键性作用，其功能是否正常直接影响着感染最终的转归。人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)的主要靶细胞是CD4+T细胞。HIV的感染不但导致CD4+T细胞数量的进行性减少，更重要的是，导致了包括CD4+T细胞和CD8+T细胞在内的T细胞的功能异常。特别是HIV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞功能异常，直接导致了HIV感染的慢性化[1]。研究表明，共抑制分子介导的抑制信号对T细胞的活化、分化和效应功能起决定性的调控作用，尤其是共抑制分子PD-1(Programmed death-1)、CTLA-4(Cytotoxic T-lymphocyte antigen-4)、Tim-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3)、BTLA(B and T lymphocyte attenuator)[2]。研究证实，这些共抑制分子不仅可作为病毒(包括HIV)慢性感染疾病进展的重要标志，更是导致HIV特异性T细胞功能缺陷和疾病进展的重要原因[3]。CD160是近期发现的一种对T细胞有抑制功能的免疫分子，它是否也参与了HIV慢性感染期的HIV特异性T细胞功能衰竭尚未完全阐明。因此，探讨CD160在HIV感染无症状者HIV特异性T细胞上表达的改变，对进一步阐明HIV感染后，T细胞功能衰竭的机制有十分重要的意义，也将为今后治疗HIV感染提供新的治疗靶点。

表1 临床基本信息表

注：HIV病毒载量为非正态分布，以中位数(范围)表示

Note： HIV load which is non-normal distribution is presented as median and range

1 材料与方法

1.1研究对象分组和入选标准选择2014年6月至2015年11月于解放军第302医院就诊的43例HIV确诊实验阳性，未经抗病毒治疗的HIV感染无症状者，及健康志愿者18例作为研究对象，留取研究对象外周血。HIV感染无症状者诊断标准参照艾滋病诊疗指南第三版(2015)，同时排除合并肿瘤、共感染HBV和/或HCV，自身免疫性疾病等。所有研究对象均签署知情同意书，实验经解放军第302医院伦理委员会批准进行。研究对象基本资料详见表1。

1.2主要试剂鼠抗人CD3-FITC、CD8-PB、CD27-PEcy7、CD45RO-APCcy7、pentamer-APC、HLA-A2-PE抗体，CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE三色抗体、溶血素及TruCount管购自美国BD公司。 鼠抗人CD160-PE及其同型对照IgG-PE抗体购自美国Bioscience公司。 HIV-1核酸PCR荧光定量检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司。

1.3全血CD4+T淋巴细胞计数测定取50 μl抗凝血加入TruCount管中，随后加入10 μl CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE三色抗体，室温避光染色20 min。加入10倍稀释的溶血素450 μl，混匀避光15 min，上机检测。

1.4病毒载量测定按照说明书，使用RT-PCR仪检测HIV感染无症状者血浆中HIV-1的病毒载量。

1.5HIV特异的抗原刺激取研究对象100 μl全血，加入10 μl HLA-A2-PE抗体，并以相应同型作为对照，按操作说明，通过流式细胞仪进行HLA-A2 的分型，如果HLA-A2 阳性加入p17 gag 蛋白上的HLA-A0201 (SL9,SLYNTVAL)表位进行刺激，如果HLA-A2阴性加入nef 多肽上的 HLA-A1101 表位(QK10, QVPLRPMTYK)及nef 多肽上的 HLA-A2402 表位(RL9, RYLKDQQLL) 刺激。

1.6FACS分析留取研究对象外周血10 ml，按常规分离单个核细胞。根据HLA-A2分析结果，对分离的细胞进行相应HIV多肽刺激，并将细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中。在37℃的5% CO2孵箱中培养72 h后收集细胞，洗涤并重新悬浮于PBS中，进行细胞计数，保证细胞浓度>2.5×106/ml，取200 μl细胞悬液置于流式管中，加入鼠抗人CD3-FITC、CD8-PB、CD27-PEcy7、CD45RO-APCcy7、pentamer-APC和CD160-PE抗体各10 μl，轻轻混匀，室温避光染色30 min，加入1 ml PBS混匀，1 200 r/min离心洗涤2次，弃去上清，加入200 μl PBS重悬。立即上流式细胞仪(美国BD公司FACS Aria型)检测。pentamer五聚体和CD160以相应克隆荧光标记作为同型对照进。采用FlowJo7.6.1流式分析软件分析流式结果。因HIV-1感染会导致CD4下调， 故以CD3+CD8-代表CD4+T细胞[4]。

表2 两组CD4+T细胞和CD8+T细胞CD160的表达情况

注：MFI为平均荧光强度

Note： MFI means median flourscence indensity

图1 CD160在HIV感染无症状者外周血HIV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞上的表达，HC为健康对照组， a表示P<0.01Fig.1 The expression of CD160 on HIV-specific CD4+ T cells and CD8+ Tcells from peripheral blood of asymptomatic HIV-infected individuals. HC means heathy controls. a indicate P<0.01

2 结果

2.1HIV感染无症状者HIV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD160的表达情况结果显示，HIV感染无症状者外周血中CD160阳性的HIV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的频数和平均荧光强度(Mean fluorescence intensity，MFI)，与对照组相比均显著升高，差异有统计学意义(如表2、图1所示)。

2.2CD160在HIV感染无症状者HIV特异性CD4+T细胞各亚群上的表达情况根据CD27和CD45的表达情况， T细胞可分为四个亚群，分别是：初始T细胞(Tn，CD27+CD45RO-), 中心记忆T细胞(Tcm, CD27+CD45RO+), 效应记忆T细胞 (Tem, CD27-CD45RO+) 和效应T细胞 (Teff, CD27-CD45RO-)。为了分析HIV感染对T细胞的影响，本研究首先分析了CD160在不同的HIV特异性CD4+T细胞亚群上的表达情况。结果显示，HIV感染无症状者的HIV特异性CD4+T细胞各亚群中，CD160阳性细胞无论频数还是MFI均较对照组升高。但与对照组相比，仅有CD160+CD4+Tn细胞的MFI，CD160+CD4+Teff细胞的频数和MFI的差异有统计学意义(如表3、图2所示)。

2.3CD160在HIV感染无症状者HIV特异性CD8+T细胞各亚群上的表达情况为了探讨HIV慢性感染阶段，HIV特异性CD8+T细胞功能的改变，我们进一步分析了CD160在HIV特异性CD8+T细胞各亚群中的表达情况。结果显示，在HIV感染无症状者HIV特异性CD8+T细胞各亚群中，CD160阳性细胞无论频数还是MFI均较对照组升高。并且与对照组相比，CD160+CD8+Tn细胞、CD160+CD8+Tcm细胞及CD160+CD8+Tem细胞的频数和MFI差异均有统计学意义(如表4、图3所示)。

表3 两组的HIV特异性CD4+T细胞各亚群中CD160表达情况

注：MFI为中位荧光强度

Note： MFI means median flourscence indensity

图2 CD160在两组中的HIV特异性CD4+T细胞各亚群上的表达情况，HC为健康对照组，a表示P<0.01Fig.2 The expression of CD160 on different subsets of HIV-specific CD4+ T cells in two groups. HC means heathy controls. a indicate P<0.01

表4 两组HIV特异性CD8+T细胞各亚群中CD160表达情况

注：MFI为中位 荧光强度

Note： MFI means median flourscence indensity

图3 CD160在两组的HIV特异性CD8+T细胞各亚群上的表达情况，HC为健康对照组，a表示P<0.01Fig.3 The expression of CD160 on different subsets of HIV-specific CD8+ T cells in two groups. HC means heathy controls. a indicate P<0.01

3 讨论

近年来研究表明，HIV感染后疾病进展的速度与机体能否产生有效的免疫应答密切相关，特别是与HIV特异性T细胞介导的细胞免疫反应强弱有关。HIV特异性CD4+T细胞主要通过三种途径控制HIV感染：①活化HIV特异性CD8+T细胞，并维持其正常功能；②一些具有细胞毒性的HIV特异性CD4+T细胞可以直接清除HIV感染；③HIV特异性CD4+T细胞可辅助B细胞产生针对HIV的中和性抗体；而HIV特异性CD8+T细胞更是控制HIV感染的直接执行者，它的出现是HIV急性感染期迅速抑制了病毒复制的关键因素和重要标志[5-7]。

但是，在HIV感染过程中，HIV特异性细胞免疫的出现，并未彻底清除HIV感染，其中一个重要原因是HIV感染后导致T细胞上调了共抑制分子的表达。近期的研究报道，共抑制分子 PD-1、CTLA-4、Tim-3及BTLA等与包括HIV在内的慢性病毒感染时T细胞功能的受损和疾病的进展密切相关[2-5]。作为共抑制分子，CD160是新近发现的一种对T细胞有抑制功能的免疫分子。研究显示，CD160对CD4+T细胞有显著的抑制功能[8]，并可抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增生[9]。对HIV感染者的淋巴组织中CDl60在基因水平上表达上调[10]。这些结果提示CD160作为一种新的共抑制分子可能参与了HIV感染过程中T细胞的功能衰竭。但是，目前对CD160在HIV特异性T细胞及其各亚群上的表达情况仍不完全清楚。

为了阐明CD160对HIV感染的影响，并避免机会性感染对患者免疫系统的影响，本研究检测了CD160在HIV感染无症状者外周血HIV特异性CD4+T细胞、CD8+T细胞及其各亚群上的表达情况。结果显示，虽然CD160在总体HIV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞上的表达频数和MFI均显著高于对照组，但对各亚群的影响有差异，且对HIV特异性CD8+T细胞影响更大。前期有研究表明，PD-1和Tim-3在HIV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞表达均上调，CTLA-4和CD160的表达则分别倾向于在HIV特异性CD4+T细胞或HIV特异性CD8+T细胞上调[11]。这与我们的实验结果一致。

不同亚群的细胞扮演着不同的角色。在T细胞的不同亚群中，初始T细胞主要作用为受到特异性抗原刺激后，分化、增生为记忆性细胞和效应细胞，中枢记忆性T细胞和效应记忆性T细胞在再次遇到相应抗原刺激时会迅速分化为效应T细胞，而效应T细胞则是具体功能的执行者。我们的结果显示，作为辅助CD8+T细胞产生HIV特异性的直接参与者，CD160在HIV特异性CD4+Teff细胞上的表达上调，可能意味着HIV特异性CD8+T细胞在分化之初即缺乏了正确的引导，而CD8阳性的Tn细胞、Tcm细胞和Tem细胞上CD160表达上调，可能直接导致了HIV特异性CD8+T细胞在受到HIV抗原刺激时分化、增生和功能的异常。

正常的免疫功能需要机体免疫组份的相互协调、辅助，任何一个环节异常，都可能使免疫功能受损。我们的研究结果提示，HIV感染的慢性化，并不仅仅是HIV特异性CD8+T细胞功能的异常，而是一个涉及辅助、分化和功能上的多个环节的异常。我们的结果也将对深入理解HIV慢性感染过程中T细胞功能衰竭的机制和共抑制因子在其中发挥的作用有重要意义。

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2017-06-06)

(本文编辑：陈培莉)

DetectionofHIV-specificTcellsandtheirsubsetsexpressingCD160inperipheralbloodofasymptomaticHIV-infectedpatients

HuangLei,TuBo,JinLei,LiFengyi,Zhangxin,WangShuqing,ZhangZheng,NieWeimin

TreatmentandResearchCenterforInfectiousDiseases,TheNo. 302HospitalofthePeople’sLiberationArmy(PLA),Beijing100039,China;ZhangZheng.ClinicalResearchCenterforTranslationalMedcine,TheNo. 302HospitalofPLA,Beijing100039,China

NieWeimin,Email:niewm302@126.com

ObjectiveTo investigate the expression of CD160 in HIV-specific T cells and their subsets in peripheral blood of asymptomatic human immunodeficiency virus (HIV) infected individuals.MethodsA total of 43 asymptomatic HIV-infected individuals without antiretroviral therapy (ART) and 18 healthy controls were recruited from the No. 302 Hospital of PLA between June 2014 and November 2015. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from peripheral bloods of these subjects. CD160 was stained with fluorescent antibody. Expression of CD160 in HIV-specific T cells and their subsets was detected by flow cytometry.ResultsThe frequency and median fluorescence intensity (MFI) of CD160 on the whole HIV-specific CD4+ T cells and CD8+ T cells were higher than those in the healthy controls(P<0.01). In subsets of HIV-specific CD4+ T cells, the MFI of CD160 in CD4+ Tn cells and CD4+ Teff cells，and the frequency of CD160 in CD4+ Teff cells were significantly increased (P<0.01). CD8+ Tn fine, CD8+ Tcm cells and CD8+ Tem cells showed a significant upregulation in the frequency and MFI of CD160 (P<0.01).ConclusionsChronic HIV infection can lead to high expression of CD160 in HIV-specific T cells and their different subsets, causing cellular immune dysfunction, which may further impair the ability to control the HIV virus.

Human immunodeficiency virus; CD160; CD4+ T cells; CD8+ T cells

聂为民，Email：niewm302@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.002

人获得性免疫缺陷病毒；CD160；CD4+T细胞；CD8+T细胞

全军医学科技“十二五”科研面上项目(CWS12J137)

FundprogramsThe 12th Five-Year Research Project of People's Liberation Army(CWS12J137)