HCV 5′非编码区基因分型与病毒复制水平的分析

王越 雷金娥 段巍 江啸 穆丽君 惠凌云 史雯欣 周聪雅 杜忆华

710061 西安交通大学医学部基础医学院病原生物学与免疫学系[王越(研究生在读)、杜忆华]；710061 西安交通大学第一附属医院检验科(雷金娥、惠凌云)；710000 西安市中心医院(段巍)；710061 西安交通大学医学部基础医学院(江啸、穆丽君、史雯欣、周聪雅)

HCV 5′非编码区基因分型与病毒复制水平的分析

王越 雷金娥 段巍 江啸 穆丽君 惠凌云 史雯欣 周聪雅 杜忆华

710061 西安交通大学医学部基础医学院病原生物学与免疫学系[王越(研究生在读)、杜忆华]；710061 西安交通大学第一附属医院检验科(雷金娥、惠凌云)；710000 西安市中心医院(段巍)；710061 西安交通大学医学部基础医学院(江啸、穆丽君、史雯欣、周聪雅)

目的研究丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)的基因分型与各基因型的病毒复制水平，为判断病情及抗病毒治疗提供参考。方法收集未经抗病毒药物治疗的抗-HCV阳性血清标本60份，经逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)及核苷酸序列分析HCV的5′非编码区，对标本进行基因分型，并采用定量-PCR检测患者的血清HCV-RNA含量。统计学数据用Graphpad Prism 5.0和SPSS21.0软件进行分析。多组间的比较采用方差分析，两独立样本比较的t检验。结果本研究人群中HCV各基因亚型的检出率依次为1b型48.3%(29/60)、3 a型23.3%(14/60)、1a型16.7%(10/60)和2a型10%(6/60)，并检出一例2c亚型。HCV 各基因亚型的血清平均病毒RNA含量的对数值log10(IU/ml)和标准差分别是：1a型 5.46±1.19、1b型6.22±0.78、2a型5.47±0.65、3a型5.38±0.98 log10(IU/ml)。结论本研究人群中1型HCV 感染率显著高于2型和3型的感染率(P<0.01)。1b亚型组血清HCV-RNA含量显著高于1a、2a和3a亚型感染人群的血清HCV-RNA含量(P<0.05)。研究HCV准确的基因分型与血清HCV-RNA含量，有助于对各基因型丙型肝炎患者抗病毒治疗方案的制定。

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是慢性肝炎的主要病原体之一，呈世界性流行，目前全球感染者约有1.7亿，感染率约为2%～2.5%[1-3]。流行病学调查显示，我国人群HCV的平均感染率为3.2%[4]，高于全球的平均感染率。HCV属黄病毒科(Flaviviridae)，是核酸为+ssRNA的有包膜病毒，通过血液、性和母婴途径传播引起丙型肝炎，HCV感染者大多病情隐匿，其中约50%～60%转为慢性肝炎，有20%的患者发展为肝硬化，并与原发性肝癌的发生关系密切[5]。HCV基因组全长约9.6 Kb，具有高度变异性，根据变异位点的核苷酸序列不同将HCV分为不同基因型。HCV基因分型通常采用Simmonds法，可分为六个基因型，其中1型进一步分为1a/1b/1c三个亚型；2型分为2a/2b/2c；3型分为3a/3b；4型有4a；5型有5a；6型有6a共11个亚型[6]。HCV基因型的分布有显著的地域性特征，在全球范围内，1-3型HCV感染最为常见，广泛分布于北美洲、欧洲及包括中国和日本在内的亚洲国家和地区；4-6型较为少见，4型见于埃及和非洲，5型见于南非，6型常分布于东南亚国家[3,7]。HCV基因组的5′端有一个319-341核苷酸的非编码区(5′non-coding region，5′NCR)是HCV基因组中最为保守的区域，有研究指出，即使在HCV最保守的5′NCR，各个基因型/亚型的核苷酸序列仍不完全相同，可根据5′NCR的序列对HCV，分出1-6六个基因型，及亚型1a/1b, 2a/2b/2c, 3a/3b, 4型有4a, 5型有5a, 6型有6a共10亚型[8]。

血清中HCV-RNA含量的检测是诊断丙型肝炎与评价抗病毒治疗的重要指标。有研究发现，感染HCV不同基因型是影响疾病严重程度和抗病毒治疗效果的主要因素[7,9]。不同基因型HCV感染者对于干扰素或干扰素联合利巴韦林治疗的敏感度差异较大，例如1型和4型HCV感染者对干扰素联合利巴韦林治疗的持续病毒学应答率(Sustained virological response, SVR)远较2型和3型感染者的SVR低[7,9-10]，这些研究结果提示HCV的基因型是影响抗病毒治疗效果的重要因素。因此，本研究拟采用通用特异性引物经5′NCR核苷酸测序对HCV进行基因分型，同时分析患者血清HCV-RNA含量与病毒基因型的关系，探讨不同基因型HCV在患者体内的复制增殖特征。

1 材料与方法

1.1研究对象收集2012年5月至2013年9月就诊于西安交通大学第一附属医院的丙型肝炎患者血清共60份,其中男性28例、女性32例。所有患者血清抗-HCV抗体阳性，诊断依据中华医学会肝病学分会2015年制定《丙型肝炎防治指南》。所有患者标本在就诊前半年内均未经过抗病毒药物治疗，并排除其它病毒性肝炎。受检者空腹采集静脉血，室温放置20 min, 3 000×g离心15 min，收集血清用于RT-PCR和定量PCR。所有患者均签署知情同意书，本研究通过西安交通大学伦理学委员会审查通过。

1.2HCVRNA提取病毒RNA提取采用E.Z.N.A viral RNA kit(R6874-01，Omega公司)，逆转录试剂盒采用TIAN Script RT Kit(KR104-01，Tiangen公司产品)，按公司提供的说明书操作，提取待检测血清中的丙型肝炎病毒RNA，进行病毒cDNA 第一链的合成。

1.3RT-PCR与HCV核苷酸测序

1.3.1 PCR引物设计：通过查询NCBI (National Center for Biotechnology Information)的Nucleotide数据库，获得HCV基因型1-6的标准株全基因组序列，Nucleotide数据库的访问号是(NC_004102.1、NC_009823.1、NC_009824.1、NC_009825.1、NC_009826.1、NC_009827.1)。各基因型的5′NCR核苷酸序列经比对(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)，得到序列高度保守的区域进行逆转录PCR(RT-PCR)特异性通用引物的设计。PCR上游引物F1(引物序列5′-CCTCCCGGGAGAGCCATAG-3′(位置是5′NCR的-216 ～ -198nt)位于高度保守，PCR下游引物及逆转录引物R2(位置是5′NCR的-23 ～-4)，引物序列为5′-CACGGTCTACGAGACCTCCC-3′)；PCR扩增产物长度为213 bp，覆盖约63%的HCV 5′NCR。由于HCV的基因型/亚型PCR扩增产物的核苷酸序列不同，通过以上通用特异性引物的RT-PCR及核苷酸测序，不仅可将HCV分出1-6型6个基因型，而且能够区分出1a/1b、2a/2b/2c、3a/3b、4a、5a和6a共10个亚型[8]。

1.3.2 RT-PCR：取2 μl RNA 2 μl逆转录引物R2 2 μl 4XdNTPs，用ddH2O定容至14.5 μl。70 ℃ 加热5 min后迅速在冰上冷却2 min。向反应体系中加入1 μl 逆转录酶TIAN Script M-MLV，混匀。42 ℃ 反应50 min后95 ℃ 加热5 min终止反应。PCR：取cDNA 2 μl,加入上游引物F1 1 μl、下游引物R2 1 μl、2x Taq mix 25 μl、ddH2O 21 μl至总体系为50 μl。置于PCR仪上按以下条件进行PCR扩增：95 ℃ 变性5 min，PCR循环温度分别为：95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，共30个循环，终延伸为72 ℃ 7 min。如果第1轮PCR产物凝胶电泳条带显示DNA量足够，可直接测序，否则需进行二次PCR。二次PCR：取第一轮扩增产物2 μl，其他条件同上PCR所述，共25个循环，终延伸为72 ℃ 7min，4 ℃ 保存，待进一步琼脂糖凝胶电泳鉴定和DNA测序分析。

1.3.3 DNA测序与分型：取PCR扩增产物20 μl,送上海生工生物工程有限公司进行DNA测序。将所得测序结果与NCBI Nucleotide数据库中各标准HCV基因型进行比对，确定HCV基因型及亚型。

1.4丙型肝炎患者血清HCV-RNA定量使用广州中山大学达安基因股份有限公司生产的HCV核酸扩增荧光定量检测试剂盒检测丙型肝炎患者血清中HCV-RNA含量。实验操作依照试剂盒说明，在ABI 7300 Real-time PCR system实时定量仪上进行。

1.5统计学方法数据采用SPSS21.0和Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析。计数资料用例数或率表示，计量资料的正态性检验采用“Kolmogorov-Smirnov Test”方法。多组间病毒计量数据比较采用方差分析，两独立样本比较采用t检验, 计量资料数据用均数±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HCV5′非编码区RT-PCR产物的电泳鉴定

取RT-PCR扩增产物5 μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳，得到长度为213 bp目的DNA扩增片段。以抗-HCV阴性志愿者血清RNA提取物作为PCR阴性对照；HCV基因组C区全序列质粒为PCR阳性对照的模板。HCV基因组C区全序列质粒由本实验室构建、保存[11]。

2.2HCV基因分型结果应用HCV的5′NCR通用特异性PCR引物．经PCR及核苷酸测序分析，60例抗-HCV阳性血清标本，均有明确的HCV基因型/亚型，可分型率为100%。基因分型结果如表1所示，该研究人群HCV感染分别属于3个基因型，5个亚型。各基因亚型感染率依次分别为1b 型48.3%(29/60)，3a 型23.3%(14/60)、1a 型16.7%(10/60)和2a型10%(6/60)，另外，检出一例较为少见的2c亚型。本研究人群未发现4、5和6型。各基因型HCV感染者在性别上差异无统计学意义(P>0.05)。HCV 1型(1a+1b)在本研究感染人群中的比率显著高于2型和3型的感染率(P<0.01)，1b亚型在本研究人群中显著高于1a、2a和3a亚型的感染率(P<0.05)。

表1 HCV基因分型与血清HCV-RNA含量平均水平

2.3HCV基因分型与血清HCV-RNA含量的结果本研究感染人群中4种亚型血清HCV-RNA含量的结果如表1所示，HCV各亚型平均血清HCV-RNA含量的对数值是1a型5.46 log10(IU/ml)、1b型6.22 log10(IU/ml)、2a型5.47 log10(IU/ml)和3a型5.38 log10(IU/ml)。4个基因亚型组的血清HCV-RNA含量经方差分析，结果显示，1b亚型组的平均血清HCV-RNA含量最高，差异具有统计学意义(P<0.05)。进一步采用t检验，对各基因亚型组之间血清HCV-RNA含量进行两两比较，1b亚型组与1a、2a和3a各亚型之间t检验结果见表1(均P<0.05)。1a、2a和3a各亚型组，两组之间血清HCV-RNA含量比较结果均差异无统计学意义(均P>0.05)。

3 讨论

慢性丙型肝炎是由HCV感染引起，主要经血液、性和母婴等方式传播。HCV基因型/亚型的分布有明显的地域性。流行病学调查显示，中国大部分地区流行的HCV 以1b型为主，其次是2a型[12]。不同地区的感染人群中HCV基因型分布差异较大，雷华等[13]对176份云南地区献人群进行HCV基因分型研究，结果显示3b型感染为主，其次为3a和1b型。研究发现静脉吸毒人群中3型和6型的流行率较高[14]。本研究随机选取未经抗病毒治疗的抗-HCV抗体阳性血清标本60例，发现该人群中HCV感染以1型为主(占65%)，其次是3型。其中1a型感染率16.7%(10/60)、1b型48.3%(29/60)，2a型10%(6/60)，3a型 23.3%(14/60)，并检出其他地区少见的2c 亚型1例。测序法仍然是HCV基因分型的金标准。本研究的HCV基因分型法采用了多型通用的特异性引物对，针对HCV 5′NCR的核苷酸测序，对丙型肝炎患者感染的HCV进行基因分型，该方法特异性强、灵敏度高、操作方法简便，且准确性高，可检出Simmonds分型法[6]的HCV主要的6个基因型和10个基因亚型[8]。60例标本均有明确的基因型及亚型，可分型率为100%，表明该方法的灵敏度较高，但该方法不适合HCV多型别混合感染标本的分型。有研究指出，由于HCV的5′NCR在各个基因型/亚型的核苷酸序列和结构不同，而且5′NCR没有病毒基因的重组，因此针对5′NCR进行HCV基因分型和病毒定量的准确性均高[8]。

血清中HCV-RNA含量是判断病毒复制增殖和慢性丙型肝炎患者抗病毒疗效的重要指标，对HCV的基因分型与血清HCV-RNA含量关系的研究有助于了解病毒复制、疾病进展的情况和相关危险因素。Blatt等[9,15]大规模的研究了美国丙型肝炎患者HCV基因分型与血清HCV-RNA含量的相关性，发现1型HCV感染者血清HCV-RNA含量显著高于2型和3型感染者血清HCV-RNA含量。Berg等[16]研究了德国379例丙型肝炎患者的HCV基因分型和血清HCV-RNA含量，也指出1型感染者的血清HCV-RNA含量显著高于3a型。本研究分析了HCV基因型/亚型与血清HCV-RNA含量的关系，发现二者有相关性，经单因素方差分析显示，1型HCV感染者血清HCV-RNA含量显著高于2型(2a)和3型(3a)感染者(P<0.05)，尤其是1b亚型感染者血清HCV-RNA含量显著高于1a、2a和3a亚型 (P<0.05)。而1a、2a和3a各型之间，血清HCV-RNA含量差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究结果与美国和德国科研人员所做的大规模研究结果基本一致[9,15-16]。有学者指出，血清HCV-RNA检测水平受众多因素影响，例如血清的处理方式、贮存条件，以及患者丙型肝炎病程长短等因素[17]。HCV是单链RNA病毒，血清标本中的HCV RNA极易被RNA酶降解，因此所采集的血清标本应立即进行HCV-RNA定量检测。用于分型的HCV RNA应及时进行逆转录反应，否则血清标本应保存于-80 ℃，从而最大程度的保证HCV-RNA不被降解和检测结果的准确性。近年来，有大量研究显示，感染不同基因型HCV，临床上表现出病情的严重程度不同，发现1型HCV感染者，尤其是1b亚型感染者较其他型别HCV感染在临床上表现出较严重的肝炎[5,9]。进一步研究发现，丙型肝炎患者对于抗病毒治疗的反应也部分取决于感染的HCV基因型，1型感染者不仅血清HCV-RNA含量水平高于其他型别的HCV感染者，而且发现HCV基因1型感染者对干扰素或干扰素联合利巴韦林治疗的SVR显著低于2型和3型感染者的SVR，由此提出，针对1型HCV感染者的抗病毒治疗应该采用干扰素加利巴韦林的联合治疗，并持续至少48周[9-10]。因此，深入研究便于临床应用的、准确的HCV基因分型方法，可能对预测丙型肝炎的预后和选择抗病毒治疗方案有一定的意义。

本研究应用特异性通用引物对，针对HCV的 5′NCR测序对HCV进行基因分型，该方法特异性强、灵敏度高，可检出HCV主要的6个型别及10个基因亚型。本研究进一步分析了HCV的基因型与血清HCV-RNA含量的关系发现，1b亚型感染者血清HCV-RNA含量显著高于1a, 2a和3a亚型的血清HCV-RNA含量，显示丙型肝炎患者血清HCV-RNA含量与HCV基因型有相关性。这一结果提示可能1b亚型HCV在体内的复制较强，这方面还需要进一步的体内实验和体外实验来加以证实。针对慢性丙型肝炎患者的抗病毒药物治疗，需进一步研究HCV基因分型，并结合血清HCV-RNA定量分析，可能有助于科学的指导临床抗病毒治疗策略和方案的确定。

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2017-07-18)

(本文编辑：唐浏英)

AnalysisofhepatitisCvirus5′non-codingregionforviralgenotypingandthelevelofviralreplication

WangYue,LeiJin′e,DuanWei,JiangXiao,MuLijun,HuiLingyun,ShiWenxin,ZhouCongya,DuYihua

DepartmentofPathogenicMicrobiologyandImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061,China[WangY(Graduatestudent),DuYH];DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061,China(LeiJE,HuiLY);Xi′anCentralHospital,Xi′an710000,China(DuanW);SchoolofBasicMedicalSciences,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061,China. (JiangX,MuLJ,ShiWX,ZhouCY)WangYueandLeiJin′econtributedequallytothearticle

DuYihua,Email：ydu@mail.xjtu.edu.cn

ObjectiveTo investigate hepatitis C virus(HCV)genotyping and the serum HCV-RNA concentration in patients infected with different HCV genotypes and to provide information for evaluation of disease condition and anti-viral treatment efficacy.MethodsA total of 60 anti-HCV positive serum samples were collected before antiviral treatment. RT-PCR was performed for the 5′ non-cording region and was followed by nucleotide sequencing for HCV genotyping. Meanwhile, serum HCV-RNA concentration was detected by quantitative PCR. SPSS21.0 and Graphpad Prism 5.0 software were used for data analysis. Analysis of variance (ANOVA) was used for comparison among multi-groups and the t-test was used for comparison between two groups.ResultsThe frequencies of HCV genotypes 1b, 3a, 1a and 2a were 48.3% (29/60), 23.3% (14/60), 16.7% (10/60) and 10% (6/60), respectively. And, there is one subtype 2c was detected in this study. The mean serum viral concentration with standard deviation of HCV in genotype 1a, 1b, 2a, and 3 a were 5.46±1.19, 6.22±0.78, 5.47±0.65, and 5.38±0.98 log10(IU/ml) respectively.ConclusionsThe infection rate of HCV genotype 1 was significantly higher than that of genotype 2 and 3 (P<0.01). The statistical analysis showed the serum HCV-RNA concentration in patients with subtype 1b was significantly higher than that of the subtype group 1 a, 2 a, and 3 a (P<0.05). The study of the relationship between HCV genotypes and the serum HCV-RNA concentration may contribute to anti-viral treatment prescription for hepatitis C patients.

Hepatitis C Virus; 5′non-cording region; HCV genotyping; Serum HCV-RNA concentration

王越与雷金娥对本文有同等贡献

杜忆华，Email： ydu@mail.xjtu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.008

丙型肝炎病毒；5′非编码区；HCV基因分型；血清HCV-RNA含量

陕西省自然科学基金(2012JM4044)

FundprogramsNatural Science Foundation of Shaanxi Province(2012JM4044)