云南省2006—2015年狂犬病病毒核蛋白基因进化特征分析

冯云 章域震 杨卫红 潘虹 张云智 袁庆虹 韩茜 周济华 张海林

671000 大理，云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室

云南省2006—2015年狂犬病病毒核蛋白基因进化特征分析

冯云 章域震 杨卫红 潘虹 张云智 袁庆虹 韩茜 周济华 张海林

671000 大理，云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室

目的阐明云南省2006—2015年118株狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)核蛋白(Nucleoprotein, N)基因进化特征及流行病学特点。方法在云南省狂犬病流行区采集狂犬、可疑犬和病牛脑组织以及狂犬病病例脑组织、唾液和脑脊液标本，用直接免疫荧光法进行病毒抗原检测，阳性标本提取病毒核酸，通过RT-PCR扩增RABV的N基因序列并进行序列测定，用MEGA5.0软件邻接法(Neighbor-Joining)进行系统进化分析。结果经RT-PCR和序列测定获得2012—2015年云南省91株RABV的N基因序列，并与2006—2011年获得的云南27株RABV及邻省和东南亚地区的29株RABV的N基因序列进行系统进化分析。结果表明，云南RABV进化群可分为YN-A(105株)、YN-B(6株)和YN-C(7株)，并分别属于中国进化群中的China-I、China-VI和China-II。YN-A流行株在2006—2015年间每年均有分布，其中，2006—2011年14株，2012—2015年91株，并分布于13个州(市)；YN-B和YN-C分别仅分布于2006—2010年和2008—2011年，地区分布也较为局限。YN-A和YN-C与相邻四川、贵州、广西和湖南省的China-I或China-II进化群流行株亲缘关系较近，YN-B与缅甸、泰国、越南和柬埔寨流行株亲缘关系较近。结论云南省RABV存在不同传播来源的3个进化群。YN-A为优势进化群，在2006—2015年间广泛分布于云南省狂犬病流行区，并具有较强的传播速率。2012年以来云南省未再发现YN-B和YN-C进化群的流行。

狂犬病是一种由狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)引起的致死率几乎100%的急性脑脊髓炎。RABV呈世界性分布，几乎感染所有的哺乳动物。犬咬伤是人感染狂犬病的主要途径[1-3]。归因于养犬数量的激增，尤其是农村地区，20世纪80年代，狂犬病在我国大范围流行，90年代得到控制。我国新一轮狂犬病大流行起始于本世纪初，几乎席卷整个中国，虽然近几年疫情有下降趋势但仍未得到有效控制[4-6]。

云南省位于我国西南边陲，狂犬病疫情较邻省温和，但仍属于我国狂犬病的高发地区[6-7]。RABV核蛋白(Nucleoprotein, N)或糖蛋白(Glycoprotein, G)基因全序列的系统进化分析表明，我国的RABV可划分为6个进化群(China-I、II、III、IV、V和VI)，各省有不同的分布[8-9]。以往研究显示，云南境内流行的RABV进化群可分为YN-A、YN-B、YN-C和YN-D，并依次属于China-I、China-VI、China-II和China-III[7]，RABV的遗传多样性提示该省RABV来源的复杂性[7, 10-14]。本研究于2012—2015年在云南省狂犬病流行区获得91株RABV N基因序列，同时使用本课题组2008—2011年获得的RABV病毒株以及GenBank国内外RABV病毒株的N基因序列进行系统进化分析，以期阐明云南RABV的分布和进化特征。

1 材料与方法

1.1标本采集在云南省狂犬病流行地区采集狂犬、可疑犬和病牛(被狂犬咬伤而发病的牛)脑组织标本，狂犬病病例唾液、脑脊液和尸检脑组织标本(其中1例为贵州省盘县狂犬病例到昆明就医并死于昆明)。所有标本置于密封冻存管中，4 ℃冷藏箱立即运送到云南省地方病防治所检测。

1.2RABV抗原检测使用荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体(Chemicon, Temecula, CA, USA)对脑组织标本进行直接免疫荧光试验(DFA)。按文献方法操作[15]，荧光显微镜下观察结果。观察到翠绿色点状荧光，即可判定为阳性。阳性标本贮存于-80 ℃冰箱，备用。

1.3RABV核酸检测使用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)试剂提取病毒RNA。用Ready-To-Go You-Prime First-strand Beads (GE Healthcare, USA)反转录合成cDNA。巢式PCR法扩增RABV N基因片段。扩增引物及操作方法见：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，2012年狂犬病监测和实验室检测技术培训班教材，北京，2012，6—13，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.4N基因全序列测定选择RABV核酸检测阳性样本，使用50 μl反应体系，用Go Taq Green Master Mix (Promega, USA)进行PCR扩增。使用两对引物，NQ(5′-ATGTAACACCTCTACAATGG-3′和5′-GCCCTGGTTCGAACATTCT-3′)和NH(5′-AAGATGTGYGCYAAYTGGAG-3′和5′-GGATTGACRAAGATCTTGCTCAT-3′)[16]。反应体系依次加入Go Taq Green Master Mix 25 μl、上下游引物各1 μl、去离子水18 μl、DNA 5 μl，充分混匀。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。反应结束后，取2 μl产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。PCR产物在生工生物工程上海有限公司完成测序。

1.5序列分析使用DNAStar软件中的SeqMan对获得的核苷酸序列进行编辑；用MEGA 5.0软件邻接法(Neighbor-Joining method)进行系统进化分析。本研究引用来自GenBank中29株RABV N基因序列，其中东南亚国家等12株，国内其他省份17株(四川4株、贵州3株、广西3株、湖南3株、湖北1株、重庆1株、福建1株、内蒙古1株)。

2 结果

2.1序列测定2012—2015年在云南省各地采获的标本经DFA和RT-PCR检测，RABV核酸阳性者经N基因全序列扩增和测序，共获得91株云南RABV的N基因核苷酸序列，其中来自犬脑组织85株、牛脑组织1株、人脑组织5株。本次测定的91株RABV分布于云南省13个州(市)及贵州省盘县(紧邻云南省曲靖市)(表1)。所有本次测定的云南91株RABV N基因核苷酸序列均已提交GenBank，序列号：CYN1262D-CYN1383D株依次为KP072009-KP072030，CYN1385D-CYN13115H株为KP202418-KP202448，CYN14116H- CYN15143D和CYN15145D株依次为KT932670-KT932698，CYN15146D-CYN15151D和CYN15153D-CYN15155D株依次为KX096992-KX097000。还获得此前本室测定的2008—2011年云南23株RABV N基因序列[7]以及张文东等[10]测定的2006—2007年云南4株RABV(Md06、Zt07、Qj07和Tc06)的N基因序列(表1)。

表1 云南省118株狂犬病病毒的地区和年度分布

2.2进化分析使用上述2006—2015年云南118株RABV的N基因核苷酸序列与来自GenBank的29株RABV国内外参考株N基因序列构建系统进化树，图1显示，云南株可分为3个进化群，称为YN-A、YN-B和YN-C。YN-A有105株，包括2012—2015年所有91株及2006—2011年14株，地区分布几乎涉及所有本次调查地区，并与四川株(包含在图1的YN-A黑色三角中，即为图2中看到的JX005941、JX005944、JX005942和JX005943株)高度聚为同一进化支，它们均与贵州株(DQ666295)、湖南株(DQ666317、EU008919、EU008920)和湖北株(EU159380)同属China-I进化群。YN-B有6株，包括2006年1株(保山Tc06)、2008年3株(曲靖CYN0810D、西双版纳CYN0812D和昭通CYN0818D)、2009年1株(红河CYN0923H)和2010年1株(德宏CYN1009D)，属于China-VI进化群，并与东南亚进化群(缅甸EU086164、老挝EU086194、泰国GQ303556、越南EU086209、柬埔寨EU086167、中国广西FJ594278和DQ866 111株)同在一个分支。YN-C有7株，包括2008年2株(西双版纳CYN0811D和昭通CYN0814D)、2009年3株(玉溪CYN0920H、玉溪CYN0922H 和红河CYN0924H)、2010年1株(普洱CYN1008D)和2011年1株(西双版纳CYN1134H)，并与广西株(DQ866120)和贵州株(DQ 666289)同属China-II进化群。

图1 云南省2006—2015年118株狂犬病病毒N基因序列系统进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis on the N gene sequences of 118 rabies virus strains in Yunnan from 2006 to 2015

为进一步阐明YN-A进化群病毒株间的进化关系及其与相邻省份流行株间的进化关系，单独使用YN-A病毒株(包括本次测定病毒株中具有代表性的22株及2006—2011年云南省代表株8株)与邻省同属China-I进化群的9株RABV构建系统进化树。图2显示，所有YN-A病毒株间同源较高，但亦存在一定差异，如2009—2015年的病毒株间亲缘性较近并与四川2009年和2010年流行株(JX005941、JX005944、JX005942和JX005943)进化关系最为接近；2006年和2007年YN-A流行株(Md06、Qj07和Zt07)则与2004—2006年贵州(DQ666295)、湖南(DQ666317、EU008920和EU008919)和湖北(EU159380)流行株同处一个独立进化亚支，具有较近的亲缘关系，但与2009年以后YN-A流行株存在明显差异。

注：▲ 2012—2015年狂犬病病毒云南株；● 2006—2011年狂犬病病毒云南株图2 2006—2015年30株YN-A进化群狂犬病病毒N基因序列系统进化分析Note:▲ The rabies virus strains in Yunnan from 2012 to 2015；● The rabies virus strains in Yunnan from 2006 to 2011Fig.2 Phylogenetic analysis on the N gene sequences of 30 YN-A strains of rabies virus from 2006 to 2015

2.3同源性分析使用118株云南RABV N基因序列进行同源性比较，核苷酸和氨基酸同源性YN-A病毒株间分别为97.7%～100%和99.1%～100%，YN-B间分别为99.2%～100%和99.3%～100%，YN-C间分别为99.1%～100%和98%～100%。云南不同进化群间核苷酸和氨基酸同源性YN-A与YN-B病毒株间分别为89.1%～89.7%和97.6%～98.7%，YN-A与YN-C间分别为88.2%～90.1%和96.2%～98.7%，YN-B与YN-C间分别为88.1%～89.9%和95.6%～97.8%。

3 讨论

云南省地理位置较为特殊，北部和东部与我国狂犬病高发省区(四川、贵州和广西等)相邻，西部和南部与狂犬病地方性流行的缅甸、老挝和越南相连，因而狂犬病流行受到周边地区疫情的影响。云南省20世纪80年代发生的狂犬病大流行于90年代中期得到控制，新一轮狂犬病流行始于2000年，随后发病数逐年上升，疫区范围不断扩大，2010年达到高峰，随后逐年下降[7]，但至今仍在流行且新发县区还在增加。不同地区RABV流行株存在一定差异并具地域特征，因此，开展RABV的监测，阐明各地RABV的分子生物学特征对了解病毒进化和传播来源具有重要公共卫生意义。以往研究表明，云南RABV具有多样性及传播来源较为复杂的特点[7, 10-14]，并存在YN-A、YN-B、YN-C和YN-D共4个进化群[7]。本研究对2006—2015年云南省13个州(市)的118株RABV N基因序列的进化和同源性分析表明，云南省存在YN-A、YN-B和YN-C三个进化群，并基本阐明了各进化群的地区和时间分布特点及其与相邻省份和东南亚流行株的进化关系，为防控本病提供了重要参考资料。此前仅有来自GenBank的1株云南早期RABV被鉴定为YN-D(China-III)[7]，随后云南未再发现该进化群。本次未检测到YN-D表明，近10年云南未再出现该进化群的流行。

本研究发现，YN-A流行株广泛分布于云南各州(市)流行区并贯穿于整个调查期间，在2006—2011年属优势进化群(同期伴随有YN-B和YN-C)，2012—2015年则成为云南RABV流行的单一进化群。YN-A属于China-I进化群，鉴于China-I进化群为我国广大地区尤其是云南相邻省份的优势进化群[8, 9]，认为该进化群病毒是通过犬类流动由邻近省区传入滇东南和东北地区，并逐步向滇中和滇西地区扩散，如楚雄、大理、保山、临沧、德宏和怒江州(市)近几年的疫情及本次从当地犬和病例中检测到的病原体均为YN-A病毒株。这些流行特征足以证明YN-A已经发展成为主导云南狂犬病流行的主要进化群。

YN-B和YN-C的地区和时间分布较为局限，并于2012—2015年未再发现这两个进化群的流行。YN-B属于China-VI，在我国分布较为局限。YN-B病毒株与东南亚主要进化群的亲缘关系和同源性均较高，YN-B首次于2006年在滇西保山市腾冲县犬类中检测到[10]，随后于2006和2007年分别从该市隆阳区和腾冲县狂犬病病例中也检测到[11]，并于2008和2009年在滇南的西双版纳和红河州、滇东曲靖市和滇东北昭通市以及滇西德宏州梁河县(2010)犬类中相继检测到YN-B病毒。这些结果提示，2006—2010年，YN-B从滇西南境外传入并在保山、德宏和西双版纳局部中缅边境地区流行，进而通过犬只流动将该病毒远距离传播到滇东和东北地区乃至其它省份[7]。YN-C属于China-II，China-II在我国流行时间较长，在2004年之前该进化群与China-I均具有相似的传播扩散特点，然而，近几年传播速率逐渐减弱，分布较为局限[8, 17]。YN-C最早于2008年从昭通和西双版纳检测到，2009和2010年在玉溪市、红河州及普洱市也检测到，2011年再次在西双版纳检测到，之后未再发现该进化群。这些结果提示，虽然YN-C形成从滇东北到滇西南的一条传播链，但仅在有限的地区维持了较短时间，与China-II的传播特点较为相似[8]。YN-B和YN-C流行株的传播为何不断减弱和消失，并被YN-A完全替换的机理有待进一步研究。

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2017-05-27)

(本文编辑：吕新军)

PhylogeneticanalysisofthenucleoproteingenomeofrabiesvirusesinYunnanprovince,Chinafrom2006to2015

FengYun,ZhangYuzhen,YangWeihong,PanHong,ZhangYunzhi,YuanQinghong,HanXi,ZhouJihua,ZhangHailin

YunnanInstituteofEndemicDiseasesControlandPrevention,YunnanProvincialKeyLaboratoryforZoonosisControlandPrevention,Dali671000,China

FengYun,Email:ynfy428@163.com

ObjectiveTo understand the molecular evolution characteristics of the nucleoprotein (N) genes and epidemiological feature of 118 rabies virus (RABV) strains isolated in Yunnan province, China from 2006 to 2015.MethodsThe brain tissue samples from mad dogs, suspicious sick dogs, sick cow, and human brain tissue, saliva and CSF samples from rabies patients were collected in Yunnan province to detect the viral antigen by direct immunofluorescence assay (DFA). The viral RNA from positive samples was extracted. Coding region of N gene was amplified by RT-PCR and sequenced. The phylogenetic tree was constructed by Neighbor-Joining method of MEGA5.0 software.ResultsThe sequences of N genes of 91 RABV strains in Yunnan from 2012 to 2015 were obtained. With the sequences of N genes of 27 RABV strains in Yunnan from 2006 to 2011 and 29 RABV strains from Southeast Asian Countries, the phylogenetic analysis was performed. RABV strains in Yunnan were divided into clades YN-A (105 strains), YN-B (6 strains), YN-C (7 strains), which belonged to clades China-I, China-VI, China-II respectively. Clade YN-A was epidemic every year from 2006 to 2015, of them, 14 strains from 2006 to 2011 and 91 strains from 2012 to 2015 were distributed in 13 prefectures (cities) of Yunnan. Clades YN-B and YN-C were epidemic only from 2006 to 2010 and from 2008 to 2011 respectively. The regional distribution of clades YN-B and YN-C was limited. The strains of YN-A and YN-C were closely related to the strains of clades China-I and China-II from neighboring Sichuan, Guizhou, Guangxi and Hunan provinces. The strains of YN-B were closely related to the strains from Myanmar, Laos, Vietnam and Cambodia.ConclusionsThree RABV clades with multiple transmission sources were identified in Yunnan. Clade YN-A was widely distributed in rabies endemic area in Yunnan from 2006 to 2015, and it has strong ability to spread as principal clade in Yunnan. Since 2012, clades YN-B and YN-C were not found again in Yunnan.

Rabies virus; Nucleoprotein; Gene; Phylogenetic analysis

冯云，Email: ynfy428@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.010

狂犬病病毒；核蛋白；基因；系统进化分析