‘巴厘’菠萝离体培养技术

林文秋　肖熙鸥　张红娜　刘胜辉　孙伟生　吴青松　李运合

摘 要 以菠萝品种‘巴厘的吸芽或腋芽为外植体，从灭菌消毒、愈伤组织和芽的诱导、继代增殖、生根培养和练苗移栽等方面，阐述了菠萝组织培养技术及存在问题。

关键词 菠萝 ；‘巴厘 ；离体培养

中图分类号 S668.3 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.10.010

In Vitro Culture of Yellow Mauritius Pineapple

（Ananas comosus L. Merr.）

LIN Wenqiu XIAO Xi'ou ZHANG Hongna

LIU Shenghui SUN Weisheng WU Qingsong LI Yunhe

（1 South Subtropical Crop Research Institute， CATAS， Zhanjiang， Guangdong 524091；

2 Hainan Provincial Engineering Research Center for Pineapple Germplasm Innovation

and Utilization， Zhanjiang， Guangdong 524091）

Abstract Suckers and axillary buds of yellow Mauritius pineapple （Ananas comosus cv Yellow Mauritius） were used as explants for tissue culture， and the tissue culture and its arising problems in sterilization， callus and shoot induction， subculture for proliferation， rooting， hardening off and transplanting were described.

Keywords pineapple ； yellow Mauritius pineapple ； in vitro culture

菠蘿（Ananas comosus L.）属于凤梨科凤梨属植物，是热带和亚热带地区的著名水果，也是世界重要的水果之一。我国是菠萝十大主产国之一，其产区主要分布在广东、海南、广西、福建、云南等省份[1]。生产上主要通过从菠萝植株上长出的各种新芽（吸芽、冠芽、裔芽和块茎芽）进行扦插繁殖，存在繁殖系数低[2]，生长速度慢，种苗生长不一致，容易携带病菌等问题[3]，不利于生产。而组织培养技术具有繁殖系数高，苗期一致等特点，有助于菠萝品种的推广与更新换代。自aghion和Beauchesue[4]于1960以冠芽为外植体进行离体繁殖获得成功后，研究人员对不同品种的菠萝组织培养进行研究，建立了不同品种的再生体系[5-7]。随后，对影响菠萝组织培养因素的研究发现菠萝再生受到多种因素的调控：（1）基因型是影响菠萝再生的重要因素之一，不同品种再生率不同[8]；（2）外植体类型影响菠萝再生率[9-10]；（3）植物生长调节剂对菠萝再生有着重要的作用。研究表明，适当添加激素有助于菠萝高效再生体系的建立。其中，6-BA在菠萝外植体芽的增殖和分化过程中起着关键作用[11-12]；（4）培养时间和继代次数对愈伤组织和芽的分化有影响。同一继代次数的不同培养时间芽的增殖数量不同[12]。此外，不同培养方式愈伤组织的诱导和芽的分化率存在显著差异，Ayenew等[13]研究发现，菠萝丛生芽在瞬时浸没式生物反应器下进行培养，其再生率高达95%。

‘巴厘菠萝自1953年引进我国后，因其汁多、味甜、产量稳定、田间易管理等特点，成为我国主栽品种之一，约占全国菠萝种植面积的80%，主要分布在广东徐闻地区[14]。为获得整齐一致的‘巴厘菠萝脱毒苗，满足生产需求，降低种植成本，保存创新菠萝种质资源和今后的开发利用，笔者通过对该品种的外植体诱导、继代增殖、生根培养及组培苗移栽等技术进行研究，建立了‘巴厘菠萝的高效再生体系。

1 ‘巴厘菠萝组织培养技术

1.1 取材及消毒

1.1.1 取材

供试材料为生长健壮、无病虫害的 ‘巴厘品种的吸芽或腋芽，采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所种质资源圃。

1.1.2 消毒

在晴天采下生长健壮的吸芽或腋芽，从基部剥除衰老叶片后，用自来水将芽冲洗干净，在吸芽生长点上方约5 cm处切断所有叶片，将芽和着生在吸芽上的白色叶基放入2% NaClO消毒10 min，无菌水冲洗3次，再放入0.1% HgCl消毒8 min，无菌水冲洗3次。

1.2 组织培养

1.2.1 直接再生途径

用灭好菌的手术刀，将消毒好的外植体纵切成2～3块，接种于MS+2.0 mg/L 6-BA+2.5 mg/L NAA的固体培养基上进行启动培养，培养20～30 d后，从叶腋处萌发出不定芽。将不定芽从基部切下，转接于MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA培养基上进行继代增殖，继代周期为25～30 d，增殖系数约为3（图1）。

1.2.2 愈伤组织、芽的诱导和增殖

将菠萝品种‘巴厘吸芽的叶基接种在MS+3 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA培养基上，诱导30 d后，从切口处产生结瘤状愈伤组织，诱导率约为60%。不同培养时间愈伤组织鲜重质量增加率结果表明，培养20 d后，鲜重增加率达到最大值，随后下降，因此，愈伤组织最佳继代周期为20 d （图2）。将愈伤组织转接于MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的分化培养基上，26℃，1 500 lx的光照条件下进行培养，20 d后部分愈伤组织的球形节状表面出现小绿点，然后小绿点伸长长大，形成丛生芽。将丛生芽切成单株，转移到分化培养基上进行继代培养，芽逐渐长高，30 d后形成再生植株。继代周期为25～30 d（图1）。endprint

1.2.3 诱导生根

将获得的组培苗切成单株转接至培养基（MS+ 2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA）中，培养25～30 d。当不定芽长至株高2 cm左右、有3～5片叶时，将其沿基部切下，接到生根培养基上诱导生根，生根培养基为MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，培养条件同继代培养一致。培养15 d后小苗基部开始长根30 d后，长出10条左右较粗的根，生根率可达90%～100%（图1）。

1.2.4 练苗移栽

为了提高组培苗的移栽成活率，在移栽前需进行练苗。当小苗有3～5条1 cm以上的不定根时，逐步开盖练苗3～5 d，取出小苗，将根部培养基洗去，晾干，移到透气性和保湿性良好的泥炭土中，浇定植的水，保持湿润，遮荫1～2周后长出新根和新芽。移栽成活率可达95%（图1）。

2 存在问题及建议

在生产上，传统的菠萝繁殖方法是通过母体抽生的各类芽（冠芽、吸芽、裔芽）进行无性繁殖，存在繁殖系数低，种苗一致性差，易携带母体的病虫害，易发生变异，导致种质的退化等问题。此外，通过无性繁殖既制约了优良品种的推广和应用，也不利于品种的调整和改良。而利用组织培养技术可以获得大量脱毒且生产性状一致的种苗，满足生产需求，为进行品种的改良和更换提供技术支撑。研究人员通过对不同菠萝品种组织培养技术的研究，虽然建立了不同品种的再生体系[15-19]，但都出现不同程度的植株变异，变异率约为0.031%～34%，阻碍了菠萝组培苗工厂化的进程[20-26]。因此，在菠萝组织培养过程中，如何减少或者避免体细胞无性系变异的发生，降低组织培养的成本，有利于推进菠萝工厂化育苗和品种的更新换代，加快菠萝产业化发展进程。

参考文献

[1] 石伟琦，孙伟生，习金根，等. 我国菠萝产业现状与发展对策[J]. 广东农业科学，2011，38（3）：181-186.

[2] 郑加协，李华东，甘勇辉. 蜜宝菠萝组织培养及低成本快繁技术研究[J]. 果树学报，2005，22（1）：27-30.

[3] 符运柳，徐 立，李志英. 金菠萝种苗组织培养技术[J]. 现代农业科技，2016（1）：121-122.

[4] Aghion D， Beauchesne G. The use of the sterile tissue culture technique to obtain pineapple clones[J]. Fruits Doutre Mer， 1960（15）： 464-466.

[5] Zuraida A R， Shahnadz A H N， Harteeni A， et al. A novel approach for rapid micropropagation of maspine pineapple （Ananas comosus L.） shoots using liquid shake culture system[J]. African Journal of Biotechnology， 2011， 10（19）： 3 859-3 866.

[6] Acheampong S， Galyuon I K A， Asare A T. Effects of sterilization protocols， benzylaminopurine and type of explants on growth initiation of pineapple [Ananas comosus （L.） Merr.] cultures[J]. Journal of Basic & Applied Sciences， 2016， 1（3）： 50-65.

[7] 何業华，罗 吉，吴会桃，等. 菠萝叶基愈伤组织诱导体细胞胚[J]. 中国果业信息，2007，24（3）：59-63.

[8] De Wald M G， Moore G A， Sherman W B， et al. Production of pineapple in vitro. Plant Cell Reports， 1988（7）： 535-537.

[9] 吴昭平，卢丽芬，沈雪玉. 菠萝杂交种子杂交苗的组织培养[J]. 植物生理学报，1984（6）：40.

[10] Souza B M， Molfetta-Machado J B， Freschi L， et al. Axillary bud development in pineapple nodal segments correlates with changes on cell cycle gene expression， hormone level， and sucrose and glutamate contents[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2010， 46（3）： 281-288.

[11] Hamad A M， Taha R M. The effect of different hormones and incubation periods on in vitro proliferation of pineapple （Ananas comosus L.） Merr cv. smooth cayenne） shoot-tip culture[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences Pjbs， 2008， 11（3）： 386-391.

[12] Al-Saif A M， Hossain A B M S， Taha R M. Effects of benzylaminopurine and naphthalene acetic acid on proliferation and shoot growth of pineapple （ananas comosus L. merr） in vitro[J]. African Journal of Biotechnology， 2011， 10（27）： 5 291-5 295.endprint

[13] Ayenew B， Tadesse T， Gebremariam E， et al. Efficient use of Temporary Immersion Bioreactor （TIB） on pineapple （Ananas comosus L.） multiplication and rooting ability[J]. Journal of Microbiology Biotechnology & Food Sciences， 2013， 2（4）： 2 456-2 465.

[14] 董定超，李玉萍，梁伟红，等. 中国菠萝产业发展现状[J]. 热带农业工程，2009，33（4）：13-17.

[15] Sripaoraya S， Marchant R， Power J B， et al. Plant regeneration somatic embryogenesis and organogenesis in commercial pineapple（Ananas comosus L.） [J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2003， 39（5）： 450-454.

[16] Danso K E， Ayeh K O， Oduro V， et al. Effect of 6Benzylaminopurine and α-naphthalene acetic acid on in vitro production of MD2 pineapple planting materials[J]. World Applied Sciences Journal， 2008， 3 （4）： 614-619.

[17] Roostika I， Mariska I， Khumaida N， et al. The use of picloram on somatic embryogenesis regeneration of， pineapple[J]. 2011（11）： 23-24.

[18] Scherer R F， Fraga H P D F， Klabunde G F， et al. Global DNA methylation levels during the development of nodule cluster cultures and assessment of genetic fidelity of in vitro regenerated pineapple plants （ Ananas comosus var. comosus）[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2015， 34（3）： 677-683.

[19] Farahani F. Micropropagation and growth of in vitro pineapple（ananas comosus L.Merr） in Iran[J]. Plant Archives， 2014， 14（1）： 337-341.

[20] Wakasa K， Koga Y， Kudo M. Differentiation from in vitro culture of Ananas comosus[J]. Japanese Journal of Breeding， 2008， 28（2）： 113-121.

[21] 徐舜全，葛華生，张振基，等. 菠萝组织培养再分化植株的变异[J]. 广东农业科学，1991（3）：26-29.

[22] 黄德贵，郭建辉. 剥粒菠萝组织培养快速繁育种苗的研究[J]. 福建热作科技，1993（z1）：1-10.

[23] Das R K， Bhowmik G. Some somaclonal variants in pineapple [Ananas comosus （L.） Merr.] plants obtained from different propagation techniques[J]. Inter J of Trop A gric， 1998， 15（14）： 95-100.

[24] 刘 岩，钟 云，孟祥春，等. “粤脆”菠萝吸芽组织培养苗变异性调查[J]. 中国南方果树，2006，35（1）：38-38.

[25] Pérez G， Mbogholi A， Sagarra F， et al. Lorenzo. Morphological and physiological characterization of two new pineapple somaclones derived from in vitro culture[J]. In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant， 2011（47）： 428-433.

[26] Roostika I， Khumaida N， Ardie S W. RAPD analysis to detect somaclonal variation of pineapple in vitro cultures during micropropagation. Biotropia[J]. 2015， 2（22）： 109-119.endprint