阿魏酸对过氧化氢诱导A375细胞凋亡的保护作用研究

李伟++++++郑坤++++++曲岩++++++陈丽娟++++++王加志

[摘要] 目的 觀察阿魏酸对氧化应激诱导的黑素细胞凋亡的影响。 方法 采用随机数字表法将A375细胞分为五组：空白对照组，模型组，阿魏酸高、中、低浓度组。空白对照组常规培养，模型组和阿魏酸各浓度组培养基中加入过氧化氢，使其终浓度为0.1 mmol/L，处理4 h。采用荧光染料DAPI染色细胞，荧光显微镜观察各组细胞凋亡情况，Caspase活性试剂盒测定各组细胞Caspase活性。 结果 与空白对照组相比，模型组Caspase-3、8、9活性水平显著升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。模型组细胞核、细胞质内可见致密浓染的颗粒，松散淡染的新月体或环状荧光，提示过氧化氢可诱导A375细胞凋亡。与模型组比较，阿魏酸高浓度组可显著下调Caspase-3和Caspase-8的表达，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），但对Caspase-9作用不明显。阿魏酸高剂量组细胞核呈均匀亮蓝色，无致密凝集现象，阿魏酸低、中浓度组大多数细胞细胞核出现染色质凝集和边缘化。 结论 阿魏酸通过下调过氧化氢诱导的Caspase活性而起到保护黑素细胞凋亡作用。

[关键词] 阿魏酸；Caspase；凋亡；A375细胞；氧化应激

[中图分类号] R758.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（b）-0011-03

[Abstract] Objective To observe the effect of ferulic acid on the apoptosis of melanocyte induced by oxidative stress. Methods According to random number table， A375 cells were divided into five groups： control group， model group， and high， middle， low concentrations of ferulic acid groups. Cells in the control group were cultured normally， while peroxide hydrogen was added into the cultured A375 cells of model group and high， middle， low concentrations of ferulic acid groups at the final concentration of 0.1 mmol/L， duration for 4 hours. The cells were stained with fluorescent dye DAPI. The apoptosis of each group was observed by fluorescence microscope. Caspase active kit was used to measure the activity of Caspase in each group. Results Compared with the control group， the activities of Caspase-3， 8 and 9 in the model group were significantly increased， with statistically significant differences （P < 0.01）. In the model group， dense and concentrated particles and the loose light colored crescent or annular fluorescence could be seen in the nucleus and cytoplasm， which implied that hydrogen peroxide can induce apoptosis of A375 cells. Compared with the model group， the expression of Caspase-3 and Caspase-8 were significantly reduced in the high does concentration of ferulic acid group， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）， but the effect on Caspase-9 was not obvious. The nucleus of cells in the high does concentration of ferulic acid group were even bright blue， without the phenomenon of dense condensation. There were chromatin agglutination and marginalization of most cell nucleus in the low and medium does concentrations of ferulic acid groups. Conclusion Ferulic acid can protect the apoptosis of melanocyte through lower the activity of Caspase induced by hydrogen peroxide.

[Key words] Ferulic acid； Caspase； Apoptosis； A375 cells； Oxidative stressendprint

皮肤黑素细胞凋亡是色素缺失性皮肤病发病的主要因素[1]，而凋亡的诱发因素中，氧化应激损伤占重要地位[2]。在生理状态下，L-酪氨酸经过一系列氧化反应最终形成黑色素，在这一过程中会同时引起表皮中过氧化氢的蓄积，而表皮黑素细胞在合成黑素小体的过程中也可导致胞浆内活性氧（ROS）蓄积[3]，当自由基的产生超出机体清除能力时，会产生氧化应激损伤。黑素细胞受氧化攻击后易发生凋亡[4]，黑素细胞凋亡又是色素缺失性皮肤病发病的重要原因，传统中药当归对本病有较好的治疗作用[5-6]，但其有效成分研究较少。阿魏酸（4-羟基-3-甲氧基肉桂酸）是桂皮酸的衍生物之一，也是当归的主要活性成分。研究显示，阿魏酸对过氧化氢导致的细胞损伤有很好的保护作用[7-8]。本研究在前期研究基础上，观察阿魏酸对黑素细胞氧化应激损伤的影响，为色素脱失性皮肤病治疗和药物研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

阿魏酸标准品（0773-9910）购自中国药品生物制品检定所，人黑素瘤细胞（A375）购于武汉细胞典藏中心；胎牛血清（NXB0568）、胰蛋白酶（SH30042.01B）、DMEM培养基（AC10220191）（HyClone公司）；二甲基亚砜（D5879）（Sigma公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（ST476）、细胞培养用双抗（C0222）、噻唑蓝（MTT）（ST316）、Caspase3（C1115）、Caspase8（C1151）、Caspase9（C1157）活性检测试剂盒、DAPI染色液（C1005）（碧云天生物技术研究所）；MK3型酶标仪（热电上海仪器有限公司），过氧化氢等其他试剂均为国产分析醇。荧光显微镜（U-RFL-T，奥林巴斯）。

1.2 细胞培养与受试药

A375细胞常规培养，培养液由DMEM培养基、FBS、双抗按89∶10∶1比例配制。在处于对数生长期时，经胰蛋白酶消化，1000 r/min离心，弃上清用新鲜培养基重悬细胞，分瓶培养。待细胞生长至融合度达约70%时，随机数字表法将细胞分为空白对照组，模型组，阿魏酸低、中、高浓度组。空白对照组常规培养、模型组和阿魏酸各浓度组均预先用含0.1 mmol/L过氧化氢的培养基预处理相同时间。在前期工作中本课题组已摸索到阿魏酸在100 μmol/L浓度时增殖作用最强[9]，本研究以100、1、0.1 μmol/L 3个浓度进行后续实验，并命名为高浓度、中浓度和低浓度组。

1.3 凋亡形态学

调整细胞浓度约为2.0×104个/mL接种在24孔板中，每孔1 mL，每组设3个复孔。药物作用结束后弃培养基，用PBS清洗2次，按说明书操作，荧光显微镜测定。

1.4 Caspase-3、8、9活性测定

调整细胞数为1.5×104个/mL接种在96孔板中，每孔200 μL，每组设6个复孔。空白对照组加培养液常规培养，各实验组加入含不同浓度药物的培养基，每孔200 μL，繼续培养24 h后，按说明书要求操作，酶标仪405 nm波长测定各孔OD值。Caspase酶活性用OD405值表示。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿魏酸对A375细胞形态学的影响

正常细胞的细胞核为暗蓝色，颜色较深，在用含过氧化氢培养基作用1～2 h后，细胞形态变化不明显，过氧化氢作用4 h出现较明显的凋亡形态改变，细胞核呈明亮鲜艳的蓝色荧光，作用8 h细胞出现部分死亡，见图1。空白对照组细胞核的荧光为弥散均匀的圆形或椭圆形；模型组细胞核或细胞质内可见致密浓染的颗粒、新月体或环状荧光，呈松散和淡染状，提示过氧化氢可诱导A375细胞凋亡；阿魏酸高剂量组细胞核呈均匀亮蓝色，无致密凝集现象；阿魏酸低、中剂量组大多数细胞细胞核出现染色质凝集和边缘化。见图2。

2.2 各组Caspase-3、8、9活性比较

与空白对照组相比，模型组Caspase-3、8、9活性显著升高（P < 0.01），说明氧化应激可诱导Caspase活性升高；与模型组相比，阿魏酸高浓度组对过氧化氢引起的Caspase-3、8酶活性升高有下调作用，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），下调后水平与空白对照组相比差异无统计学意义（P > 0.05）；而阿魏酸中、低浓度组的抑制作用不明显。见表1。

3 讨论

白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病，发病率高，虽无明显的自觉症状，由于皮损部位黑素保护功能缺失，在日光照射下可出现局部皮肤潮红、瘙痒，严重者出现皮炎。白癜风因皮肤上的皮损色差影响患者的容貌，造成患者精神上的巨大压力，影响其工作、学习和生活。氧化应激致色素细胞功能异常并导致皮肤黑素的代谢障碍，产生白癜风等色素缺失性皮肤疾病[10-11]，严重者可累及毛发，造成灰发、白发等[12-13]。有研究证实，白癜风患者表皮黑素细胞存在氧化应激状态，并存在水平不断增高的现象[14-17]。氧化应激可通过线粒体、内质网和死亡受体等细胞内外途径引起黑素细胞的凋亡，促进了白癜风的发生、发展[18]。本研究从黑素细胞氧化应激损伤角度入手，以含0.1 mmol/L过氧化氢的培养基作用于A375细胞，造模方法参考了田军等[19]的研究结果，以细胞形态学和Caspase为观察对象，探讨阿魏酸对氧化应激诱导的黑素细胞凋亡的影响。

细胞凋亡过程中伴随着明显的形态学改变，通过使用荧光染料染色可以通过形态学改变观察细胞在凋亡中的进程。DAPI是一种结合于DNA双链的荧光染料，对凋亡过程中的DNA变化可以作出准确反映。观察含0.1 mmol/L过氧化氢的培养基作用细胞1、2、4、8 h后DAPI染色，结果可见，作用1、2 h对细胞损伤作用不明显，作用4 h开始出现较明显的变化，作用8 h后细胞死亡较多，不利于后续实验。本研究以0.1 mmol/L过氧化氢作用4 h为处理条件。在用药后，细胞凋亡的中心环节是由Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应，其激活过程主要包括胞外死亡受体介导和线粒体依赖途径，依次激活下游的Caspase，通过切割特异性底物，导致细胞凋亡过程的不可逆。Caspase-8、9都是细胞凋亡过程中的关键因子，参与该过程的程序化调控，这些因子受外源死亡受体途径和内源线粒体途径的激活，Caspase-8、9是两个途径的共同部分。在应激状态下，酶原形式的Caspase-8、9活化并激活Caspase-3触发细胞凋亡[20]。本实验检测了各组细胞中Caspase-3、8、9的活性，结果显示：模型组Caspase-3、8、9活性水平显著高于空白对照组，提示过氧化氢所致的氧化应激可激活A375细胞凋亡基因，阿魏酸高剂量组可显著下调Caspase-3和Caspase-8的表达，从而抑制过氧化氢诱导的A375细胞凋亡，这可能是阿魏酸抗细胞凋亡作用机制的环节之一，中、低剂量组作用不明显。endprint

综上所述，阿魏酸通过下调过氧化氢诱导的Caspase活性而起到调节细胞凋亡作用。

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