芝麻脂肪氧化酶活性测定

曹世娜，孙 强，黄纪念，高锦鸿

(河南省农业科学院 农副产品加工研究所，河南 郑州 450002)

芝麻脂肪氧化酶活性测定

曹世娜，孙 强*，黄纪念，高锦鸿

(河南省农业科学院 农副产品加工研究所，河南 郑州 450002)

为了明确芝麻脂肪氧化酶活性测定的适宜条件，采用紫外分光光度法测定芝麻脂肪氧化酶的活性并对测定的适宜条件进行探讨。结果表明，芝麻脂肪氧化酶活性测定的最佳反应条件为：取2.95 mL 0.05 mol/L的磷酸缓冲液(pH值6.2)、20 μL 10 mmol/L的底物亚油酸钠、50 μL酶液迅速混匀后，立即在紫外光234 nm处观察OD值的变化，最适检测反应时间为0～1.5 min。将吸光度代入公式计算酶活性。此外，芝麻脂肪氧化酶活性随酶液保存时间的延长而下降，应将酶液保存在4 ℃条件下并于1 h内进行测定。酶液添加量为10～50 μL时，酶活力(y)与酶液添加量(x)成正比，y=0.084 6x+5.858，且线性关系良好(R2=0.999 8)。精密度试验结果显示RSD为0.027%，建立的方法方便快捷，稳定性好，可广泛使用。

芝麻； 脂肪氧化酶； 活性测定； 紫外分光光度法

脂肪氧化酶(LOX)在动植物界广泛存在[1]，现有研究表明，LOX与动植物生长发育、衰老、抵抗有害生物和伤害的反应有关[2-4]。目前，LOX活性的检测方法主要有紫外分光光度法[5-6]、显色法[7]、单克隆抗体检测法[8]、氧电极法[9]和量压法[10]，其中最为简易和常用的方法是紫外分光光度法。其原理为：LOX能使催化底物亚油酸氧化形成具有共轭双键的过氧化氢衍生物，反应体系在234 nm波长处有吸收峰，通过吸光度可以推算出LOX活性[11]。研究表明，利用紫外分光光度法测定LOX活性的一个重要前提是底物溶液的透明度[12]，反应温度、反应底物浓度和反应缓冲体系的pH值等多种因素均会影响测定结果[13]。

芝麻是我国主要的油料作物之一，具有较高的应用价值，其种子含油量高达55%。芝麻储存不当容易走油、生虫。LOX是油料脂肪代谢途径中的关键酶[14-15]，能催化油料中不饱和脂肪酸氧化，产生醛、酮等有害物质，对油料的储藏[16-18]、加工[19]和种子发芽率[17]都有重要影响。为了延长芝麻的保质期，通常用热处理的方式来钝化芝麻中的LOX，但过高的加热温度与过长的加热时间会导致芝麻中其他营养成分的损失，降低营养价值。因此，探索适当的加热温度和加热时间是高效钝化芝麻LOX的关键，在此过程中，及时准确地测定芝麻LOX的活性尤为重要。相对于大豆和花生，芝麻LOX活性的测定研究鲜有报道。鉴于此，采用紫外分光光度法对芝麻LOX活性的测定条件进行了探讨，并重点对pH值、磷酸缓冲液的浓度、酶液用量、酶的反应速度及酶液的保存时间进行了详细地分析，旨在为准确快速地测定芝麻LOX活性提供参考。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器有TGL 20M-Ⅱ台式高速冷冻离心机、JP0540超声波萃取器、UV-6300型紫外可见分光光度计、MTN-2800D氮吹浓缩装置、XK96-B快速混匀器；主要试剂有氢氧化钠(分析纯)、盐酸(分析纯)、亚油酸、磷酸二氢钠(分析纯)、磷酸氢二钠(分析纯)。

1.2 试验方法

1.2.1 酶液的制备 将1 g完整的芝麻粉碎，加入20 mL Tris-HCl缓冲液(0.05 mol/L，pH值7.0)，超声提取15 min，于4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min，取上清液放入4 ℃冰箱备用。

1.2.2 底物(亚油酸钠，10 mmol/L)的制备 准确称取140 mg亚油酸和140 mg吐温20，加入8 mL脱氧蒸馏水，在试管中反复振荡使其均匀，避免产生气泡。加入0.5 mol/L的NaOH溶液1.1 mL后溶液变澄清，移入50 mL容量瓶中用脱氧水定容，分装在2 mL左右的带螺旋盖的小瓶中，拧盖前冲入氮气，在18 ℃下保存备用。

1.2.3 芝麻LOX活性的测定 采用UV-6300紫外可见分光光度计测定芝麻LOX活性，设定检测波长234 nm，检测时间为75 s，间隔15 s记录一次数据，重复5次取平均值，吸光度代入公式计算LOX活性。参比液：磷酸缓冲液2.95 mL、10 mmol/L亚油酸钠溶液20 μL、钝化处理的酶液50 μL，迅速混合均匀后放入分光光度计中归零；反应液：磷酸缓冲液2.95 mL、10 mmol/L亚油酸钠溶液20 μL、酶液50 μL，迅速混合均匀后放入分光光度计中读数并记录。

1.2.4 芝麻LOX活性计算 按照公式A=4×(OD75 s-OD0 s)/5/0.01计算芝麻LOX活性。式中，A为LOX的活性单位数(U)；OD75 s为反应75 s的吸光值；OD0 s为反应刚开始时的吸光值；0.01为常数，以每分钟增加0.01吸光值所需要的活性作为芝麻LOX的一个活性单位。

2 结果与分析

2.1 pH值对芝麻LOX活性的影响

测定芝麻LOX活性时，反应体系的pH值直接影响测定的灵敏性和准确性[20]。分别配制pH值为5.0、5.4、5.8、6.2、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，浓度为0.1、0.2 mol/L的磷酸缓冲液，然后分别取2.95 mL磷酸缓冲液、20 μL 10 mmol/L的底物(亚油酸钠)溶液和50 μL芝麻酶液，混合均匀后测定吸光值，根据吸光值计算芝麻的LOX活性。

由图1可见，磷酸缓冲液的浓度分别为0.1、0.2 mol/L时，反应体系中LOX活性的变化基本相同：在pH值为5.0～5.8时，LOX活性先稍微下降，而后又快速上升，在pH值为6.2时达到最大值，之后快速下降。当pH值为5时，0.1、0.2 mol/L的磷酸缓冲液中LOX活性分别为4.32、4.48 U；当pH值为6.2时，0.1、0.2 mol/L的磷酸缓冲液中LOX活性分别为9.44、8.80 U。因此，选用pH值为6.2的磷酸缓冲液作为酶反应体系。

图1 pH值与芝麻LOX活性的关系

2.2 磷酸缓冲液浓度对芝麻LOX活性的影响

分别以pH值为5.0、6.2，浓度为0.05、0.10、0.20 mol/L的磷酸缓冲液作为反应体系测定芝麻LOX活性。由表1可见，pH值为5.0条件下，磷酸缓冲液浓度为0.20 mol/L时LOX活性最大；pH值为6.2条件下，磷酸缓冲液浓度为0.05 mol/L时测得的LOX活性最大，比pH值为5.0时高5.88 U。因此，选用0.05 mol/L磷酸缓冲液作为酶反应体系。

表1 不同浓度与不同pH值磷酸缓冲液中芝麻LOX活性 U

2.3 酶液用量对芝麻LOX活性的影响

用2.95 mL磷酸缓冲液(0.05 mol/L，pH值6.2)与20 μL底物混合均匀，然后分别取10～90 μL酶液，测定LOX活性，结果如图2所示。由图2可知，当酶液添加量为10～50 μL时，LOX活性随酶液添加量的增加而不断增大，呈明显的线性关系[酶活力(y)与酶液添加量(x)成正比:y=0.084 6x+5.858，且线性关系良好(R2=0.999 8)，图3]。因此，在本试验方法中，测定芝麻LOX活性时，酶液用量选定为50 μL比较合适。

图2 酶液添加量与LOX活性的关系

图3 酶液添加量与LOX活性的线性关系

2.4 反应时间对芝麻LOX活性的影响

选用浓度为0.05 mol/L、pH值为6.2的磷酸缓冲液，以50 μL酶液添加量为试验条件，监测吸光度值的变化，结果如图4所示。在0～1.5 min，酶反应速度非常快；1.5 min以后，酶反应速度随反应时间的增加而缓慢增长。根据图4可知，测定时宜取0～1.5 min的平均反应速度来反映芝麻的LOX活性。

图4 不同反应时间的酶反应速度

2.5 酶液保存时间对芝麻LOX活性的影响

酶液提取后置于4 ℃条件下，分别保存1、2、3、4、5、6 h后测定LOX活性，结果如图5所示。由图5可知，LOX活性随酶液保存时间的延长明显降低，保存3 h后，LOX活性已经降低1/2，说明酶液提取后LOX活性较难保持，因此，测定LOX活性应在酶液提取后(4 ℃条件下保存)1 h内进行。

图5 酶液保存时间与LOX活性的关系

2.6 精密度试验结果

取2.95 mL pH值为6.2、浓度为0.05 mol/L的磷酸缓冲液与20 μL亚油酸钠溶液混合后，快速加入50 μL酶液并混合均匀，在234 nm处观察OD值，测定LOX活性。对样品做了3次平行，平行1的LOX活性分别是9.72 U和9.68 U，均值为9.72 U；平行2的LOX活性分别是9.44 U和9.20 U，均值为9.32 U；平行3的LOX活性分别是9.52 U和10.08 U，均值为9.80 U。3次平行的平均值为9.61 U，重复性标准偏差较小(0.26)，方法可靠性较高，RSD为0.027%。

3 结论与讨论

芝麻中粗脂肪含量在50%以上，LOX活性的大小与芝麻耐储藏性、产品风味及其产品保质期有直接联系。这是因为，LOX是一类含非血红素铁的蛋白酶家族，主要通过催化多元不饱和脂肪酸发生双加氧反应生成脂肪酸氢过氧化物，再经一系列不同酶的作用，最终生成具有一定生理功能的小分子醛、醇和酮等代谢产物，从而对芝麻耐储藏性、产品风味及其产品保质期产生直接影响。因此急需建立一种高效、准确的芝麻LOX活性测定方法，以有效监测芝麻及其制品在储藏过程中品质的变化。本研究采用分光光度法，探讨了芝麻LOX活性测定的适宜条件，结果显示，芝麻LOX活性测定的优化条件为：磷酸缓冲液浓度为0.05 mol/L，pH值6.2；酶液用量50 μL；最适检测反应时间为0～1.5 min。此外，芝麻LOX活性随酶液保存时间的延长而下降，应将酶液保存在4 ℃条件下，并于1 h内测定。在优化条件下，酶液添加量为10～50 μL时，酶活力(y)与酶液添加量(x)成正比:y=0.084 6x+5.858，且线性关系良好(R2=0.999 8)。精密度试验结果显示RSD为0.027%，该方法方便快捷，稳定性好，可广泛使用。

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A Spectrophotometric Method for Determining the Activity of Lipoxygenase in Sesame

CAO Shina,SUN Qiang*,HUANG Jinian,GAO Jinhong

(Institute of Agricultural Products Processing,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

In order to ascertain the suitable conditions for the determination of lipoxygenase activity in sesame,the activity of lipoxygenase in sesame was determined by ultraviolet spectrophotometry and the measured conditions were discussed.The results showed that the optimal reaction conditions were as follows: 2.95 mL of phosphate buffer (0.05 mol/L,pH 6.2),20 μL of sodium linoleate (10 mmol/L) as the substrate,and 50 μL of enzyme solution.Blend them quickly and immediately observe the change of OD value at 234 nm UV light.The optimal reaction time was 0—1.5 min.The enzyme activity was calculated using the equation according to the absorbance value.In addition,the activity of lipoxygenase in sesame decreased with the elongation of the storage time of the enzyme solution,which should be kept at 4 ℃ and measured within 1 h.When the added volume of the enzyme solution was between 10—50 μL,the enzymatic activity(y) was in direct proportion to the enzyme volume(x),y=0.084 6x+5.858,and the linear relationship was good (R2= 0.999 8).The results of the precision test showed that theRSDwas 0.027%,and the established method was convenient,stable and suitable for wide application.

sesame; lipoxygenase; activity determination; UV spectrophotometry

S565.3

A

1004-3268(2017)11-0048-04

2017-07-17

公益性行业( 农业) 科研专项(201303072)

曹世娜(1983-)，女，河南南乐人，中级工程师，硕士，主要从事油料加工研究。E-mail:407452454@qq.com

*通讯作者：孙 强(1973-)，男，河南信阳人，副研究员，硕士，主要从事油料加工与副产物综合利用研究。

E-mail:qiangsunxy@126.com