用HPLC—荧光检测同时测定阿莫西林和克拉维酸钾浓度

王立东+聂彦彦

摘 要：目的：本文主要使用了随机交叉给药方法针对12名男性进行调查。方法：实验人员选择试验药阿莫西林及其克拉维酸钾干混悬剂的比例为4：1，以及对照药阿莫西林和相关克拉维酸钾干混悬剂比例也同样为4：1，精准量取50Omg的阿莫西林，125mg的克拉维酸钾，这个时候实验人员通过人体生物利用度及其药代动力学进行了详细的比较。实验人员使用了HPLC荧光对这两种药品存在的含量进行了检测。结果：无论是试验药还是对照药里面阿莫西林的Tmax1.58±0.36和1.56±0.34h；而Cmax13.94±2.20和13.38±2.67mg·L-1；T121.57±0.19和1.53±0.23h；AUC52.28±8.22和50.24±9.44mg·L-1，对于生物利用度来说，为104.89%±7.73%。克拉维酸钾的Tmax0.96±0.37和1.06±0.50h；Cmax2.13±0.44和2.69±0.99mg·L-1，T121.27±0.19和1.28±0.32h；AUC5.38±0.83和5.66±1.04·h·L-1；相对生物利用度95.91%±11.21%。结论：实验人员通过对AUC及其Cmax通过方差的形式进行分析，就Tmax而言，实验人员主要使用非参数法进行统计的，在这两种制剂里面，无论是阿莫西林还是克拉维酸钾这两个小组呈现出的都是生物等效。

关键词：阿莫西林；克拉维酸；生物等效性

阿莫西林以及相关的克拉维酸钾干混悬剂是在比例为4：1的成分下得到的复方制剂，并且每一包都含有125mg的阿莫西林，31.25mg的克拉维酸钾。本实验的主要目标是实验人员将试验药阿莫西林及其相关的克拉维酸钾干混悬剂在4：1的比例下能够和对照药阿莫西林及其相关的克拉维酸钾干混悬剂在4：1的比例存在的生物利用度进行详细的对比。在以往发展的过程中，实验人员大部分是对阿莫西林及其相关的克拉维酸钾存在的血药进行检测的，并利用生物法来对阿莫西林及其相关的克拉维酸钾分别检测的，这样做会致使检测流程较为复杂，并且有着较多的工作量，尤其是对克拉维酸钾检测增加了一定的难度。而依据国内国外文献可以得知，采取HPLC-荧光检测法来对这两种物质进行检测，然而由于克拉维酸钾仅仅是在末端紫外吸收，这个时候实验人员需要通过咪唑生化以后哦再进行检测，该方法往往会受到相关因素带来的影响。在本文中第一次尝试使用HPLC-荧光法对这两种药品的浓度进行检测，有着显著的效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

试验药品：阿莫西林一克拉维酸钾（：41）干混悬剂（每包125：31.251119/包），批号981130。

对照药品：阿莫西林一克拉维酸钾（：41）干混悬剂（每包阿莫西林125mg-克拉维酸31.25mg），批号981111，（95）卫药准字X-318号。

标准品：阿莫西林含量86.2%，批号0409-9706，由中央卫生部药品检定所生产。克拉维酸钾含量82.7%。

试剂：甲醇（HPLC纯），KH2PO4，K2HPO4，苯甲醛，无水乙醇均为分析纯试剂。苯甲醛用无水乙醇配制成2%浓度，混匀后避光保存。

1.2 色谱条件

岛津LC-10AHPLC仪，RF-10AxL荧光检测器（ex386nm，em460nm），C-R6A積分仪和95色谱工作站。分析柱HypersilBDSC18200×4.6mm，5um，流动相为甲醇：水（580：520v/v），流速1ml·min-1。

1.3 受试者给药方法

12名受试者随机分为两组，每组6人，首次每组随机服用试验药品或对照药品，单剂量一次口服阿莫西林500mg，克拉维酸钾125mg，一周后各组自身交叉服用。受试者在试验前一周及试验期间禁忌用其它任何药物。在试验前一天晚饭后禁食至第二天早上8：00服药。用250mg温开水冲服干混悬剂，服药后4h允许进统一中餐。取血时间为服药0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8h，取静脉血3ml，肝素抗凝，立即分离血浆后放置-70℃冰箱待测定。

1.4 血浆样品处理

取血浆0.2ml，加入0.2ml1ol·L-1磷酸缓冲溶液（pH=7.02），用密理博微孔膜在10000转离心15min，取滤液100μl，加入150μlpH3.80lmol·L-1磷酸缓冲溶液，再加人20μl2%苯甲醛乙醇溶液，混匀，密封于安靓放入100土0.3℃烘箱20min。取出后立即在-18℃冰箱10min冷却至室温进样50ul。以外标法峰高定量。阿莫西林和克拉维酸钾在本色谱条件下的出峰时间为11.3min和8.7min，空白血浆中无杂质峰干扰。见图1。

2 结果

2.1 血药浓度测定方法的评价

2.1.1 方法的专属性

实验人员主要通过荧光检测的方式，对这两种制剂进行了详细的检测，血浆里面没有含有加多的杂志峰，这样也较好的说明不会对这两种制剂的检测带来干扰，而且这两种制剂呈现出来的峰已经处于完全分离的状态，具体内容请看图1。本法的专属性从某种意义上来说要比HPLC-UV法要好一些，没有较多的杂峰。

2.1.2 回收率和精密度试验结果

阿莫西林0.20，1.64，1，3.15m.gL-1三个浓度的绝对回收率为80%，克拉维酸钾的回收率为84%，结果见表1。日内、日间精密度试验结果见表2。

2.2 药代动力学参数和相对生物利用度结果

依据相关统计分析结果：对照药和试验药中AUC、Cmax用对数转换后作多因素方差分析和双单侧t检验，凡Tmax用非参数法统计。结果：两种制剂中阿莫西林经统计，t1，t2均大于t（0.05）=1.812；Cmaxt1=0.580.05，无显著性差异。阿莫西林和克拉维酸钾的AUC经（1-2α）90%置信区间计算，结果分别为41.86～62.69和4.70～6.39，试验药阿莫西林和克拉维酸钾分别为52.28和5.38，均落在上述区间。

3 讨论

通过以上内容的论述，可以得知：实验人员通过利用克拉维酸钾能够在酸性环境下和适量的苯甲醛乙醇溶液进行充分的反应，进而得到相应的荧光产物，并且能够在以下两个波长中进行检测：一种是ex386nm；另一种是em460nm有着显著的效果。例如，较好的特异性能、较高的灵敏度等。不仅仅如此，阿莫西林能够在色谱条件下可以和克拉维酸钾处于分离的状态并且一起被检测。

显而易见的是，实验人员在对血浆样品进行处理的过程中，一般是提前使用滤膜将其完全过滤以后，然后进行衍生化反应，这样做的目的是有着较高的回收率。在进行试验的过程中，主要使用了甲醇、乙睛等相关物质，但是得到的回收率不大于50%。出现这种情况的重要因素可能会和蛋白沉淀剂会随着相关被测物的变化而将蛋白一起带走，从而出现流失的情况。

依据相关实验结果可以得知：无论是对照药还是试验要中，实验人员都会阿莫西林的AUC、Cmax、Tmax及其克拉维酸钾的AUC和Tmax采取恰当的方式进行了分析，得到的结果可以看出两种制剂没有明显的区别。对于Cmax实测值来说，可能会受到采样的时间、吸收水平等因素的影响存在一定的区别。然而这两种制剂中，不管是对于吸收量（AUC）来说，还是就吸收速度（Tmax）而言都会当作相应的指标，并且认为这两种制剂都可以当作生物等效制剂。

参考文献

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