胡桃楸活性成分时空动态及抗肿瘤活性初步研究

罗 猛 乔 琪 牟璠松 阮 鑫 杨 璇 邢文淼 杨雨春 祁永会 段喜华*

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040； 2.吉林省林业科学研究院，长春 130033； 3.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨 150081)

胡桃楸活性成分时空动态及抗肿瘤活性初步研究

罗 猛1乔 琪1牟璠松1阮 鑫1杨 璇1邢文淼1杨雨春2祁永会3段喜华1*

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2.吉林省林业科学研究院，长春 130033；3.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨 150081)

采用超声波辅助提取方法，以胡桃楸为原料，在单因素实验的基础上研究一年内不同月份胡桃楸不同部位总黄酮、总酚的含量变化，同时对胡桃楸提取物体外抗肿瘤活性进行初步评价。结果显示，乙醇浓度60%，超声时间40 min，料液比1∶20，提取温度30℃为最佳提取参数。在此条件下，不同采摘时期胡桃楸不同部位的总黄酮、总酚含量存在显著差异。5～7月份叶和小枝的总黄酮及总酚含量明显高于8～10月份，其中7月份叶的总黄酮总酚含量最高，分别为12.56±0.33和76.98±3.73 mg·g-1，然而茎皮总黄酮、总酚含量随月份增加呈持续下降趋势。体外抗肿瘤研究表明胡桃楸叶提取物对人肝癌细胞SMMC-7721、人乳腺癌细胞MCF-7和人口腔表皮样癌细胞KB的增殖抑制作用，其中7月份胡桃楸叶提取物对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制作用更明显，其IC50值为0.24 mg·mL-1。本研究为胡桃楸资源的合理开发及利用提供一定的理论基础。

胡桃楸；总黄酮；总酚；季节动态；抗肿瘤

胡桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)又称胡桃楸、楸子或山核桃，是胡桃科(Jualandaceae)胡桃属(JuglansL.)落叶乔木，主要分布于我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西等地区[1]，为我国东北著名三大硬阔之一，是珍贵的用材树种，也是重要的药用植物，具有很高的开发价值[2]。胡桃楸的皮、叶和枝均具有消热、解毒、抗癌、镇痛等作用[3～4]。近年来的研究证实，胡桃楸中的主要化合物有黄酮类、酚类、鞣质类、二芳基庚烷类和有机酸类等[5～6]，其中黄酮类和酚类化合物具有抗肿瘤、抗菌、抑酶、抗氧化等作用[7]，对泌尿系统结石、慢性气管炎、皮炎、湿疹及痢疾等疾病具有很好的疗效[8～9]。

本文利用单因素实验对胡桃楸超声提取过程中影响总黄酮和总酚得率的主要影响因素乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度进行优化。应用优化得出的提取条件来研究不同月份胡桃楸叶、茎皮、小枝及外果皮中总黄酮、总酚含量。同时，我们分别选取人肝癌细胞SMMC-7721，人乳腺癌细胞MCF-7和人口腔表皮样癌细胞KB测定胡桃楸提取物体外抗肿瘤的活性。本文为胡桃楸的种植资源保护及其总黄酮、总酚化合物的开发利用提供理论依据。

1 实验材料

原料为胡桃楸叶、茎皮、小枝和外果皮于2015年5～10月采自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学实验林场。采收到的胡桃楸样品于恒温通风干燥箱40℃干燥至恒重后，细粉、过筛至实验所需粒度。4℃下保存备用。

2 实验方法

2.1 超声提取方法

准确称取胡桃楸样品10 g，置于锥形瓶中，加入60%的乙醇溶液200 mL，超声提取3次，每次40 min，超声功率250 W，温度35℃。过滤，合并上清液，4℃下保存备用。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度

准确称量叶片粉末1.0 g，按照料液比1∶20，依次加入20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇水溶液中，30℃条件下超声40 min，将提取液过滤。用分光光度计分别测定在波长500和765 nm处的吸光度值，重复3次。

2.2.2 提取时间

准确称量叶片粉末1.0 g，按照料液比1∶20，加入60%的乙醇溶液，提取温度30℃，提取时间10、20、30、40、50和60 min，将提取液过滤。用分光光度计分别测定在波长500和765 nm处的吸光度值，重复3次。

2.2.3 料液比

准确称量叶片粉末1.0 g，分别按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，加入60%的乙醇溶液，提取温度30℃，超声提取时间40 min，将提取液过滤。用分光光度计分别测定在波长500和765 nm处的吸光度值，重复3次。

2.2.4 提取温度

准确称量叶片粉末1.0 g，按照料液比1∶20加入60%的乙醇溶液，提取温度10、15、20、25、30和35℃，超声提取时间40 min，将提取液过滤。用分光光度计分别测定在波长500和765 nm处的吸光度值，重复3次。

2.3 胡桃楸总黄酮含量的测定

胡桃楸总黄酮含量测定采用亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠比色法测定。1 mL的样品或芦丁标准品于10 mL容量瓶中，加入60%乙醇4 mL后，加入5%(W/V)亚硝酸钠溶液0.5 mL，摇匀，放置6 min后加入10%(W/V)硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀作用6 min，再加入1.0 mL(1 mol·L-1)氢氧化钠溶液，最后用60%乙醇定容至10 mL。以每克试样中芦丁之相对含量(mg·g-1RE)表示总黄酮的含量[10]。

2.4 胡桃楸总酚含量的测定

采用福林酚比色法测定胡桃楸总酚含量。40 μL的样品或没食子酸标准品于试管中，加入1.8 mL Folin-Ciocalteu试剂，混合放置5 min，加质量分数7.5% Na2CO3溶液1.2 mL。室温下静置2 h，765 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：

Y=0.7827X+0.0498(R2=0.99)

(1)

式中：Y表示波长765 nm处的吸光度；X表示没食子酸的质量浓度。

以每克试样中没食子酸之相对含量(mg·g-1RE)表示总酚的含量[11]。

2.5 胡桃楸提取物抗肿瘤活性测定

分别同时培养人肝癌SMMC-7721细胞，人乳腺癌MCF-7细胞和人口腔表皮样癌KB细胞，取对数生长期的细胞以每孔100 μL接种于96孔板中，37℃，5% CO2培养箱中培养24 h，去上清，加入每种细胞的药物终浓度为0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg·mL-1，对照组加入100 μL的配药用培养液。每个浓度设4个平行孔，培养24 h，每孔加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，继续培养4 h，吸出培养液，加入100 μL DMSO振荡10 min混合均匀，在570 nm波长处用酶标仪测定OD值[12]。计算抑制率：

抑制率=(对照孔OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%

(2)

2.6 数据处理

采用Excel 2010软件绘图，SPSS软件方差分析，运用Duncan T法进行二因素有重复实验数据分析(P<0.05)。

3 结果与讨论

3.1 胡桃楸活性组分提取工艺优化

由图1A可以看出当乙醇浓度为60%时，总黄酮和总酚的得率最高。乙醇浓度再增高，总黄酮和总酚的得率呈现出下降趋势。原因是水会对物料起到溶胀作用，水含量较小会导致物料溶胀不充分，使得率降低[13]。不同提取时间对总黄酮和总酚得率的影响见图1B。随着提取时间的增加，总黄酮和总酚的得率呈上升的趋势，但当提取时间超过40 min时得率的增长不显著。因此选择提取时间为40 min。由图1C可知，料液比由1∶5到1∶25，总黄酮和总酚得率呈上升的趋势。料液比超过1∶20时得率增长不显著。在一定范围内，增长料液比例会使提取更充分，但料液比达到一定时，提取已经较充分，所以再增大料液比对活性物质得率的影响不大[14]。从图1D可知，提取温度由10～30℃，总黄酮和总酚得率呈上升趋势，提取温度为35℃时得率反而有所下降，可能是因为温度升高，导致对热敏感的化合物降解，使得率降低[15]。

图1 几种因素对总酚和总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of four factors on the total phenols and flavonoids contents

3.2 胡桃楸各部位不同采收时期总黄酮和总酚含量

从图2A可以看出，胡桃楸不同部位中总黄酮含量相差较大，胡桃楸叶中总黄酮含量最高，其次是茎皮，小枝和外果皮含量相对较低。胡桃楸叶5月底开始生长至8月开始衰落，在叶生长之初总黄酮含量较低，随着叶的不断生长总黄酮的含量逐渐升高，7月底胡桃楸叶最茂盛，故总黄酮的含量达一年中最高值12.56±0.33 mg·g-1。8月份胡桃楸的叶开始变黄并枯萎，此后总黄酮含量逐渐减少，到10月末胡桃楸叶总黄酮含量最低，为6.57±0.28 mg·g-1。胡桃楸小枝中总黄酮含量季节变化规律与叶的变化规律相似，但胡桃楸小枝中总黄酮含量明显低于叶中总黄酮的含量。7月份小枝总黄酮含量最高为2.28±0.06 mg·g-1，但仅为7月叶中含量的1/5。10月末胡桃楸小枝中总黄酮含量最低，为1.78±0.06 mg·g-1。然而，胡桃楸茎皮总黄酮含量变化规律呈整体下降趋势，5月茎皮中总黄酮含量最高为6.24±0.18 mg·g-1，10月末茎皮中总黄酮含量为4.05±0.05 mg·g-1。对于8、9月采收的胡桃楸外果皮样品，其中8月采收的外果皮中总黄酮的含量约是9月的1.97倍。从图2B可以看出，不同采收时期胡桃楸各部位总酚含量具有和总黄酮含量相似的变化趋势。7月叶片中总酚含量最高，为76.98±3.73 mg·g-1，茎皮中总酚含量最高为5月份，小枝和外果皮中总酚含量相对较低。

图2 胡桃楸总黄酮和总酚含量时空动态变化Fig.2 Seasonal variations on TFC and TPC in different parts of J.mandshurica

3.3 胡桃楸提取物对肿瘤细胞的抑制作用

将5～10月叶片提取物在浓度为0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg·mL-1时分别对人乳腺癌MCF-7细胞、人肝癌SMMC-7721细胞和人口腔表皮样癌细胞KB处理24 h，由图3可知，随着加入提取物溶液浓度的增大，3种癌症细胞的生存率也相应地降低，因此我们可以知道肿瘤细胞的生存率与提取物浓度具有一定的依赖性。

图3 胡桃楸叶提取物对MCF-7，SMMC-7721和KB细胞生存率的影响Fig.3 The inhibition ratios of J.mandshurica Maxim leaf extract on MCF-7,SMMC-7721 and KB cell

不同月份胡桃楸叶提取物对癌症细胞的抑制作用也有所差异。在设定浓度范围内，与其他月叶提取物相比，采自7月叶提取物对3种癌症细胞的抑制效果较突出，其对MCF-7、SMMC-7721和KB细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为0.24、0.33和0.35 mg·mL-1。根据国内的相关文献研究可知，胡桃楸树皮提取物对SMMC-7721、MCF-7也具有良好抗肿瘤活性。相比胡桃楸树皮，胡桃楸叶为可再生资源，容易获得且总黄酮及总酚含量相对较高，本文研究7月胡桃楸叶提取物对以上两种肿瘤细胞24 h的抑制作用与文献中报道的树皮提取物72 h的抑制作用效果相近[16]。因此，本研究对胡桃楸种植资源的保护以及开发利用提供一定的帮助。

3.4 胡桃楸提取物对肿瘤细胞形态的影响

将浓度为0、100、500和1 000 μg·mL-1的提取物分别处理MCF-7(A)、SMMC-7721(B)和KB(C)细胞后，3种肿瘤细胞发生了一系列形态改变。倒置显微镜下观察到对照组细胞贴壁状况良好，细胞生长增殖旺盛、细胞间相互连接，密集成片生长，折光性好。随着提取物浓度增高，实验组细胞有部分变圆浮起，细胞间接触变松，增殖减慢。如图4所示，100 μg·mL-组细胞的形态无明显变化，贴壁状况良好。当提取物浓度为500 μg·mL-1时，MCF-7和SMMC-7721细胞贴壁状况不好，大部分细胞漂浮于培养液中，并可见坏死细胞和碎片；KB细胞胞形态欠规则，呈梭形或多边形生长，少许呈圆形。当提取物浓度为1 000 μg·mL-1，3种细胞的折光性差，较暗，坏死细胞和碎片明显增多。不同浓度的胡桃楸叶提取物对3种肿瘤细胞的增殖抑制作用，随着药物浓度增加，抑制作用增强，并呈剂量依赖性。

图4 胡桃楸叶片不同浓度提取物对MCF-7(A)、SMMC-7721(B)和KB(C)细胞形态的影响Fig.4 Morphological observation of MCF-7(A),SMMC-7721(B) and KB(C) after the treatment with J.mandshurica leaf extract

3 结论

本实验首先对超声提取胡桃楸中总黄酮和总酚的因素进行了优化，得到的最佳提取条件为：乙醇浓度60%，超声时间40 min，料液比1∶20，提取温度30℃。在此条件下对一年内不同月份胡桃楸不同部位总黄酮、总酚含量的动态变化进行了研究，研究发现胡桃楸叶中总黄酮含量最高，其次是茎皮，小枝和外果皮；不同采收时期胡桃楸各部位总酚含量与总黄酮含量具有相似的变化趋势。此外，体外抗肿瘤活性结果表明，胡桃楸叶提取物抗肿瘤效果最好，在一定浓度范围内对人乳腺癌MCF-7细胞、人肝癌SMMC-7721细胞和人口腔表皮样癌KB细胞均有抑制作用。

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National Key Research & Development Program of China(2017YFD0600605)；Heilongjiang Postdoctoral Funds for Scientific Research Initiation(LBH-Q13003)；Youth Fund of National Natural Science Foundation of China(21403032)

introduction：LUO Meng(1979—),male,Doctor,mainly engaged in plant active ingredient research.

date:2016-09-02

TemporalandSpatialVariationsofActiveIngredientsinJuglansmandshuricaMaximandTheirAnti-tumorActivity

LUO Meng1QIAO Qi1MU Fan-Song1RUAN Xin1YANG Xuan1XING Wen-Miao1YANG Yu-Chun2QI Yong-Hui3DUAN Xi-Hua1*

(1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Ministry of Education,Northeast Forestry University,Harbin 150040； 2.Forestry Academy of Jinlin Province,Changchun 130033； 3.Heilongjiang Forestry Research Institute,Harbin 150081)

We used ultrasonic-assisted extractioncombined with single factor experiment to determine the dynamic changes of total phenolic and total flavonoid content from different parts ofJuglansmandshuricaMaxim,and measurethe inhibitive effect of extract fromJ.mandshuricaon tumors. The optimum extraction conditions were ethanol extract fraction of 60%, extract time of 40 min, solid-liquid ratio of 1∶20 and extraction temeperature of 30℃. According to the optimized extraction condition parameters,total flavonoid content, total phenolic content inJ.mandshuricawere significantly different during growth.Total flavonoid and phenolic contentextracted from leaves and sprig from May to Julyare higher than that from August to October. Total flavonoid and phenolic content inJ.mandshuricaleaves from July were the highest(12.56±0.33 and 76.98±3.73 mg·g-1).However,total flavonoid and phenolic content in the bark were decreased with the growth ofJ.mandshurica.Invitroanti-tumor studies show extracts fromJ.mandshuricaleaves can inhibit the growth of SMMC-7721, MCF-7 and KB cells.Extracts from the leaves ofJ.mandshuricain July significantly can inhibit the growth of MCF-7 human breast cancer cells, and the IC50is 0.24 mg·mL-1.

JuglansmandshuricaMaxim;total flavonoid;total phenolic;seasonal dynamic;antitumor activities

国家重点研发计划项目(2017YFD0600605)；黑龙江省博士后科研启动金(LBH-Q13003)；国家自然科学基金(21403032)

罗猛(1979—)，男，博士，主要从事植物活性成分研究。

* 通信作者：E-mail:duanxihua828@163.com

2016-09-02

* Corresponding author：E-mail:duanxihua828@163.com

S792.132

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.06.019