阿尔茨海默病模型大鼠脑海马内MMP-9和TIMP-1 mRNA的表达

张 美 狄婷婷 徐树雷 赵 梦 王瑞婷

(承德医学院，河北 承德 067000)

阿尔茨海默病(AD)的特征表现为患者大脑皮层和海马区的老年斑(SP)形成、神经纤维缠结(NFTs)及神经元丢失和凋亡〔1，2〕。目前，国内外研究总体认为Aβ是该病的使动因子，常以脑内注射Aβ的方法来制作AD动物模型〔3，4〕。基质金属蛋白酶(MMPs)家族参与了许多疾病的病理生理过程，如心脑血管病、动脉粥样硬化、癌症、子宫内膜异位症、关节炎、肺气肿、腹主动脉瘤形成及细胞凋亡等〔5～7〕。MMPs在体内以无活性酶原形式存在，当存在钙/锌时，产生活性并作用于细胞外基质(ECM)，使基质降解〔8〕。研究表明AD患者血清MMP-9水平升高，推测与AD疾病严重程度相关，有可能为AD诊断提供参考〔9〕。内源性基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是MMPs的天然抑制因子〔10〕，TIMP-1活性最强，可特异性抑制MMP-9的活性。另外TIMPs还具有细胞生长因子样作用，能使ECM沉积并抑制其降解〔11〕。本实验探讨AD病模型中两者mRNA的水平。

1 材料与方法

1.1实验动物及仪器 选择雄性30只Wistar大鼠，10～12周龄，体重(250±20)g，SPF级别，动物合格证号：0289310，北京维通利华实验动物技术有限公司〔许可证号：SCXK(京)2012-0001〕。主要试剂：Aβ25～35购自Sigma公司，高效液相色谱法检测纯度≥97%，Aβ25～351 mg干粉加500 μl无菌生理盐水，制成母液2 g/L，-20℃冷冻存贮。临用前，37℃温箱孵育1 w，成凝聚态。实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit，RR820A，Lot：AK4505)，RNAiso Plus(9108Q，Lot：AK7602)，DEPC处置水(9013A，Lot：AA1801A)，反转录试剂盒(RR047A，Lot：AK3701)，购自大连宝生物工程有限公司；引物的合成由TaKaRa公司提供；肿瘤坏死因子(TNF)-α(EK3822，Lot：238231215)、白细胞介素(IL)-1β(EK301B2，Lot：2301B30241)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自联科生物技术有限公司，其他试剂为分析纯。第二军医大学的江湾Ⅰ型脑立体定位仪，瑞士Hamilton公司的微量进样器，瑞士Mettler Toledo公司的AG245型电子分析天平，德国Startorius公司的BP211D精密电子天平，上海精宏实验设备有限公司的DNP-9052型电热恒温培养箱，日本Sanyo公司的MDF-192型超低温冰箱(-80℃)、低温冰箱(-20℃)、SIM-F124型制冰机，德国Sigma公司的3-16PK冷冻离心机，美国Agilent 公司的Mx3000P型实时荧光定量PCR仪等。

1.2方法

1.2.1实验动物分组和处理 选取30只成年雄性Wistar 大鼠，按体重编号1～30，随机分为A、B、C、D、E组，每组6只。分笼饲养，自然光照，自由饮水，标准饲料。A组大鼠双侧海马CA1区注射无菌生理盐水5 μl(即Aβ25～350 μg)，B、C、D、E组大鼠分别注射Aβ25～355 μl(分别含Aβ25～350.5、1.0、5.0、10.0 μg)，注射Aβ 14 d。

1.2.2制作AD模型 大鼠4%水合氯醛溶液麻醉后，将其固定在江湾Ⅰ型脑立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱进行脑立体定位海马CA1区，按预试验确定进针点进针，在10 min内用微量注射器向双侧海马缓慢注入Aβ25～35或生理盐水5 μl，留针5 min，缓慢拔针，缝合皮肤伤口，术后注射青霉素抗感染。

1.2.3血清制备及指标检测 注射药物或生理盐水最后1 d，各组大鼠心脏取血于促凝离心管，室温静置0.5 h，2 500 r/min，10 min收集上清冻存-80℃冰箱。严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，在30 min之内用酶标仪450 nm波长测定光密度(OD)值，绘制标准品拟合曲线，计算标本TNF-α、1L-1β含量。

1.2.4引物的设计与合成 以β-actin为内参照，在GenBank数据库内查找MMP-9、TIMP-1的基因序列，利用Primer premier 5.0引物设计软件进行引物设计，通过GenBank BLAST检测同源性，设计出的引物分别由TaKaRa公司合成。β-actin正义链5′-TGACAGGAT GCAGAAGGAGA-3′，反义链5′-TAGAGCCACCAATCC ACACA-3′；MMP-9正义链5′-CGCTGACAAGAAGTGG GGTTT-3′，反义链5′-TACAGATGGTGGATGCCTTTTAT G-3′；TIMP-1正义链5′-CCTGGTTCCCTGGCATAATC-3′，反义链5′-CGCTCTGGTAGCCCTTCTC-3′。

1.2.5RNA的提取与转录 取血后，大鼠左心室快速灌注生理盐水250 ml，然后灌注含4%多聚甲醛的磷酸盐酸缓冲液(PBS-T)250 ml先快后慢，1 h后断头取脑内海马，严格按照试剂盒说明书进行总RNA提取，紫外分光光度计检验RNA纯度，要求波长在260/280处吸光值为1.8～2.2。严格按照RNA反转录试剂盒反转cDNA，-80℃保存备用。

1.2.6Syber Green荧光定量PCR检测 应用TaKaRa公司提供的实时荧光定量试剂盒，总反应体系25 μl，上下游引物各10 μl(10 μmol/L)，Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μl，DEPC水8.5 μl，最后加样品cDNA 2 μl，混匀，离心，置荧光定量PCR仪中，预变性95℃，30 s，变性95℃，5 s，退火温度MMP-9(51℃)、TIMP-1(48℃)，延伸72℃ 30 s，收集荧光信号，40个循环。采用SYBR法对MMP-9和TIMP-1 mRNA水平进行检测。

1.2.7结果分析 扩增完毕，记录结果CT值，利用2-△△CT方法进行分析。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组TNF-α、IL-1β水平比较 血清TNF-α含量D组(568.65±44.66)ng/L、E组(685.06±29.92)ng/L明显高于A组(426.87±55.91)ng/L、B组(432.99±28.09)ng/L、C组(488.14±39.04)ng/L(均P<0.01)，且A、B组间差异无统计学意义(P>0.05)，B、C组间差异无统计学意义(P>0.05)，A组明显低于C组(P<0.05)，D组明显低于E组。血清IL-1β含量D组(104.60±9.32)ng/L、E组(143.38±17.09)ng/L明显高于A组(49.13±8.46)ng/L、B组(60.89±14.71)ng/L、C组(79.81±9.94)ng/L(P<0.01)，且C组明显高于A组(P<0.01)，D明显低于E组(P<0.05)。

2.2各组MMP-9、TIMP-1 mRNA水平比较 qRT-PCR结果显示，MMP-9 mRNA表达D组(4.269 6±1.489 1)、E组(7.801 6±1.258 3)明显高于B组(1.469 6±0.308 2)、C组(1.837 1±0.412 2)和A组(1.000 0±0.000 0)，D组明显低于E组(P<0.01)，A、B、C三组之间差异无统计学意义(P>0.05)。TIMP-1 mRNA表达D组(3.453 0±0.892 6)、E组(5.526 9±1.371 7)组明显高于A组(1.000 0±0.000 0)、B组(1.131 4±0.114 3)和C组(1.390 5±0.141 9)(P<0.01)，D组明显低于E组(P<0.01)，A、B、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

本实验制作经典痴呆模型，炎症因子TNF-α、IL-1β明显升高，证实痴呆模型制作成功。AD主要是Aβ在神经元附近聚集形成SP，胞内产生纤维缠结，tau蛋白磷酸化，小胶质细胞被激活并且释放炎症因子，从而导致神经元损伤。因此降解Aβ使其在大脑中的堆积减少对缓解AD有着重要作用。研究发现MMP对机体不同组织的发育和修复、肿瘤发生发展，尤其在炎症反应中起重要作用〔12，13〕。MMP-9的作用底物是Ⅳ胶原、纤连蛋白、层黏连蛋白等〔14〕，因此预测对AD患者脑内堆积的Aβ沉积有一定的降解功能。MMP-9在胞外可被特定的蛋白酶TIMP-1特异性结合。TIMP-1作为MMP-9的特异性内源抑制因子，在生理条件下和MMP-9形成1∶1的复合物，并切割MMP-9使其被激活。本实验显示MMP-9与TIMP-1之间存在动态平衡关系，且随着Aβ浓度增加，两者mRNA的表达含量都不断增加。当Aβ达到5.0 μg和10.0 μg浓度时，MMP-9、TIMP-1 mRNA水平明显升高，推测两者可能参与到Aβ25～35所致的大鼠模型炎性反应中，并且根据已有的实验推测MMP-9对胞外的Aβ进行一定程度上降解。具体降解量在什么水平，还要进一步实验证实。本实验表明MMP-9和TIMP-1确实在AD中有相应的改变，即随Aβ剂量增大，表达逐渐增加，但是否可作为诊断AD的特征指标，还有待进一步探究。本实验的不足是AD模型的建造虽属于经典造模方法，但由于对动物注射Aβ的行为也会造成脑组织局灶性穿透性损伤，且Aβ聚集于注射位点而不是弥散于脑内〔15〕，对实验结果分析也会造成一定误差，因此操作技术还需进一步完善。

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