氢谱磁共振代谢组学在2型糖尿病特征代谢物监测中的应用

张志军 马 红 董继扬

(厦门大学附属中山医院干部保健科，福建 厦门 361004)

2型糖尿病(T2DM)起病隐匿、进展缓慢，往往出现相关症状的时候，已经发展到中期甚至晚期，给家庭和社会带来沉重的负担。T2DM是多因素参与的整体代谢性紊乱，其调控机制十分复杂。以前的研究主要是利用分子生物学和生物化学等方法，通过检测单个或少数几个成分的变化来获得疾病的相关信息，忽略了整体器官中动态的代谢变化，很难了解体内的整体紊乱，也无法做到对疾病的早期预警。代谢组学技术主要提取生物体液(如尿液、血液)或组织中分子量小于1 000 kD的小分子代谢物信息，揭示系统关联生物标记物的综合差异，可以从整体上全面分析疾病对生物系统的影响，能够为糖尿病(DM)的代谢研究提供良好的技术平台。磁共振(NMR)技术作为一种非侵入和高效的检测手段，是代谢组学普遍采用的方法，广泛应用于生物体液的研究。本文将基于1H-NMR的代谢组学方法应用于T2DM尿液特征代谢物的寻找。

1 对象与方法

1.1研究对象 T2DM组：厦门大学附属中山医院内分泌科2012～2013年住院患者98例，平均年龄(58.58±8.69)岁，符合1999年世界卫生组织(WHO)T2DM诊断标准，血清谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体检测均为阴性；排除急性感染、严重营养不良、肿瘤、家族性遗传性疾病等。健康对照组：厦门大学附属中山医院体检中心2012～2013年健康志愿者82例，平均年龄(55.34±9.54)岁，血、尿常规、生化检查均无明显异常。所有参与本试验的志愿者同意参与本研究，被告知本试验的目的及意义，并签署知情同意书。

1.2样品采集 收集研究对象清晨中段尿液3 ml，收集后1 h内经台式超速离心机以3 000 r/min离心10 min，取上清液0.6 ml，放入-80℃冰箱储存，1个月内完成实验。

1.3NMR制谱 进行NMR实验时，解冻尿液样品至常温，取样品500 μl与250 μl磷酸盐缓冲液混合，以消除pH变化对化学位移的影响，加入适量的2，2-二甲基-2-硅烷-5-磺酸钠(DSS)作为化学位移零点的定标，用5 mm样品管，在Varian NMR System 5 000 MHz谱仪上采集样品1H NMR谱。实验采用5 mm HCN三共振探头，温度300 K，谱宽5 kHz，信号累加128次，用NOEPR采样并抑制水峰信号。

1.4数据预处理 采用MestRe-C 2.3软件及自编程软件对谱图的手工相位调节、基线校正和谱峰对齐。并将δ 4.5～δ 6的谱峰强度置为零，截取化学位移δ 0.7～δ 9区间，以消除残留水信号对分析结果的影响。为了减少噪声和化学位移漂移的影响，采用自适应分段积分的方法，通过分段积分，得到1个观测数据矩阵。最后将数据矩阵进行归一化和标准化，采用sup-PQN面归一化，归一后再用Pareto进行列归一，应用主成分分析(PCA)方法删除得分图上明显不符合的离群点，进行多元统计分析。

1.5统计学方法 将预处理结果导入MATLAB平台进行多元统计分析。采用PLS-DA进行判别分析及t检验。

2 结 果

2.1NMR谱图分析 根据相应的化学位移和波谱形态，可以得到尿液中主要代谢物成分信息如下：异亮氨酸(δ 0.85)、甲基丙二酸(MMA，δ 1.18)、乳酸(δ 1.33)、丙氨酸(δ 1.48)、亮氨酸(δ 1.75)、柠檬酸(δ 2.56，2.72)、二甲胺(DMA，δ 2.73)、三甲胺(TMA，δ 2.92)、肌酐(δ 3.05，4.05)、甜菜碱(δ 3.27)、氮氧三甲胺(TMAO，δ 3.27)、葡萄糖(δ 3.2～δ 4.0)等。T2DM组和健康对照组尿液中葡萄糖、氮氧三甲胺、柠檬酸水平差异有统计学意义(P<0.05)，其他代谢物的浓度变化很难识别，并且由于存在个体差异，单个样本的代谢物差异不足以代表全部样本。

2.2T2DM和健康对照组尿液代谢产物的PLS-DA分析 通过PLS-DA的模式识别分析方法，可以明显地将T2DM及健康对照组区分开。相对于健康对照组，T2DM组的样本分布比较分散，这是由于T2DM组的代谢产物个体差异较大造成的。在负载图中，葡萄糖、乳酸、乙酸的特征变量偏离负载图中心点最远，说明这三种成分是引起T2DM组和健康对照组类别差异的重要参数。除了以上3种成分，其他远离中心点的化学位移对负载图也有突出贡献，这说明导致两组样本类别差异的代谢物还包含了其他特征代谢物。根据负载图中的特征变量，我们得到了T2DM尿液中的特征代谢物，经过t检验后，T2DM与健康对照组尿液代谢产物比较，乙酸、乳酸、牛磺酸、乙酰乙酸、葡萄糖、丙氨酸、甲基丙二酸含量升高，肌酐、柠檬酸、三甲胺含量降低，差异均有统计学意义(P<0.005)。

3 讨 论

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新兴学科，也是系统生物学的重要组成部分。可实现对代谢物全面、实时、系统的轮廓分析，并且可对代谢物因饮食、生活方式、服药等影响而发生的变化进行描述和评估。实验中，由于T2DM患者存在糖代谢障碍，使丙酮酸氧化障碍，无法完全进入三羧酸循环，在细胞液中堆积，导致乳酸升高。T2DM患者普遍存在微循环障碍，细胞供氧不良，乳酸脱氢氧化成丙酮酸的过程被抑制，也是造成T2DM患者体内乳酸升高的原因。乳酸性酸中毒死亡率高，预后较差，所以对T2DM患者血液乳酸水平的检测显得尤为重要。国外研究报道，乳酸在人体内存在两种立体异构体，L-乳酸和D-乳酸，D-乳酸含量较少，但其神经毒性远大于L-乳酸，应当将D-乳酸作为单独的检测项目〔1〕。T2DM患者体内D-乳酸含量几乎为正常人的2倍，其原因目前认为是机体在高血糖状态下，由升高的丙酮醛转化而来。文献指出丙酮醛加剧了机体组织的氧化应激和糖基化过程，促进了糖基化终末产物的形成，从而加速T2DM微血管并发症和周围神经病变的进程〔2〕。作为丙酮醛的终末产物，D-乳酸可以作为其体内水平的参考。在临床上开展针对D-乳酸的检测，并深入探寻它在T2DM微血管及神经病变中的贡献，可以作为今后研究的一个方向。

相关研究发现牛磺酸具有影响糖代谢，降低血糖的作用〔3〕。国外学者对其降糖作用进行深入研究，机制主要涉及增加胰岛素的敏感性〔4〕，减少胃肠道葡萄糖的吸收〔5〕，促进外周组织对葡萄糖的利用〔6〕。此外Winiarska等〔7〕研究指出，牛磺酸可能通过抑制糖异生来达到降血糖的作用，同时发现，牛磺酸同时具有抗氧化和保护神经的作用，对T2DM并发症的预防和控制有一定作用。在本研究中，T2DM患者尿液中牛磺酸的水平升高，综合相关文献研究结果，我们考虑牛磺酸的排泄增加、体内牛磺酸水平的相对不足，可能在一定程度上参与了T2DM的发生发展。

本研究中T2DM患者尿液中的甲基丙二酸的水平升高，原因可能为：①T2DM患者体内氨基酸及脂肪的代谢异常。②T2DM患者体内维生素B12不足。有文献报道T2DM患者常用的二甲双胍、罗格列酮等药物会导致维生素B12缺乏〔8〕，本研究中T2DM患者服用二甲双胍的比例较高，我们认为这是尿液中甲基丙二酸水平增加的主要原因。美国的一项META研究指出，维生素B12、MMA的异常会增加多发性神经病变的危险性〔9〕，国内研究也表明，在T2DM患者中，维生素B12水平降低会增加T2DM患者周围神经病变的发生率〔10〕。临床上二甲双胍相关性的VitB12缺乏一直被忽略，早期的VitB12缺乏无典型的临床表现，但已经存在潜在神经系统损害〔11〕。MMA对维生素B12的早期缺乏较敏感，且MMA由肾脏排泄，尿液中含量较高，所以尿液中的MMA水平敏感地反映维生素B12的缺乏。对于长期应用二甲双胍的患者，定期监测尿液MMA的水平，预防T2DM周围神经病变的发生发展，具有一定指导意义。研究表明，多进食富含柠檬酸的食物，能够限制体内糖基化终末产物的形成，从而延缓T2DM血管病变的进程〔12〕。本研究发现T2DM患者尿液中柠檬酸的水平下降，这可能也是引起微血管病变的因素。

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