不同老化处理时间对棉花种子生理生化的影响

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(1.洛阳理工学院环境工程与化学系， 河南 洛阳 471023； 2.河南科技大学农学院， 河南 洛阳 471003)

种子老化是种子贮藏过程中普遍存在的一种现象，不但影响种子的萌发和幼苗生长及后期种子的产量与品质，而且对种质资源的保存、开发和利用等都产生严重的影响[1]。到目前为止，国内外关于许多种作物种子老化及劣变的机理过程研究已经进行了很多，但种子老化的具体内部机理还存在很多疑问，对种子老化过程中的生理生化变化还有待进一步的研究。目前，一般认为膜脂超氧化作用及自由基增加是引起或加剧种子老化劣变的重要原因[2]，但其具体的老化过程以及其中的生理生化变化还不清楚。因此，进行人工模拟种子老化的相关研究，揭示种子老化机理并进一步找出相关减缓种子老化速率的应对策略，对于种质资源保存和环境保护以及作物的繁殖生产具有重要的现实意义。本试验通过人工加速老化的方法对棉花品种进行研究，为提升种子安全贮藏，解析种子衰老机理，提高种子科学利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材 料

棉花种子(鲁棉10号)、无水乙醇、10%三氯乙酸(TCA)、0.6%硫代巴比妥酸(TBA)、pH=7.8的磷酸缓冲液、氮蓝四唑(NBT)溶液、石英砂等。

1.2 实验方法

1.2.1 种子老化

随机拣选大小相同，健康的种子900粒进行试验，将选好的平均分成18份，将分好的种子放入人工老化处理箱(LH-80型)中，设置温度50 ℃，相对湿度100%进行模拟老化处理，处理时间分别为0(ck)，2，4，6，8，12 d，3次重复。老化处理结束后，将种子取出，实验室自然条件下晾干备用。

1.2.2 发芽实验

采用沙培法进行标准发芽试验[3]。培养4 d后，统计不同处理时间种子的发芽数(以芽长超过种子1/2为发芽标准)进行统计，记录数据。发芽率(%)=发芽总数/供试种子总数×100%；发芽势(%)=4 d内正常发芽的种子数/供试种子总数×100%；发芽指数=∑(Gt/Dt)，式中：Gt为在时间t内的发芽个数；Dt为发芽天数。

1.2.3 POD、SOD活性、MDA含量的测定

选取发芽第12天的棉花幼苗为材料，取其下胚轴用于测定POD、SOD的活性[4]和MDA的含量[5]。

1.2.4 相对电导率的测定

本试验采用浸泡法测定棉花叶片的电导率。每组处理取幼苗材料0.5 g，用蒸馏水冲洗3次洗净，用吸水纸将叶片表面的水滴吸干，将叶片处理适宜的形状，分别放置于50 mL的三角瓶中，密封后放置于25 ℃恒温培养箱中浸泡1 d，对浸泡后的溶液用电导率分析仪进行电导率测定，而后将各处理煮沸30 min，室温下冷却，再对煮沸后浸泡溶液进行绝对电导率测定。

1.2.5 数据处理

用SPSS for windows 11.5与 Excel 2007版本软件进行单因素方差分析与作图，计算结果以均数表示，检验水准α=0.05。其中，小写字母表示5%显著差异，大写字母表示1%极显著差异。

2 结果与分析

2.1 不同老化处理时间对棉花种子发芽的影响

从表1可以看出，随着老化处理时间的延长，棉花种子的发芽率、发芽势以及发芽指数都逐渐下降。在老化试验2 d内种子的发芽率、发芽势降低很慢，处理2 d的棉花种子发芽率和发芽势降低值仅为对照的7.66%、3.34%。从老化处理4 d开始，种子的发芽势和发芽率发生显著性下降，老化处理12 d的棉花种子发芽率仅为50%。从表1还可以看出，发芽指数对种子老化反响最敏感，从老化开始发芽指数就表现出在0.05水平上的显著下降。

表1 不同老化处理时间对种子发芽指标的影响

处理天数(d)发芽率(%)发芽势(%)发芽指数088.00aA40.67aA22.35aA280.34bAB37.33abA20.08bA474.00cB34.00bAB15.53cB669.34cBC28.67cB15.89dC862.67dC16.00dC9.27eD1250.00eD12.67dC7.53fD

注：表中小写字母表示p<0.05水平差异显著；大写字母表示p<0.01水平差异显著。

2.2 不同老化处理时间对棉花种子MDA含量的影响

种子 MDA含量的大小从一定水平上反映出细胞结构破坏的程度。从图1可以看出，种子幼苗中MDA含量随老化处理时间的延长而逐渐增加。在老化处理2 d内，种子幼苗下胚轴中MDA 含量变化很小，即老化处理2 d对种子的活力并没有太大的影响，而2～4 d内MDA的含量发生了显著的变化，这与表1内种子的发芽率、发芽势急剧下降相符合，说明这段时间内种子的活力急剧老化。老化处理4 d后，种子幼苗中丙二醛含量缓慢增加，并没有发生显著的变化。

图1 不同老化处理时间对棉花种子MDA含量的影响

2.3 不同老化处理时间对棉花种子SOD、POD活性的影响

细胞中的SOD、POD活性能反映出细胞质膜的完整性以及细胞损伤程度。由图2和图3可以看出，随着老化时间的延长，种子幼苗中SOD、POD活性慢慢降低，2种酶的活性变化基本一致。从图3还可以看出，在处理2～4 d时种子中SOD活性明显下降，这与图1中MDA含量的增加相符合。在老化12 d时，种子幼苗中SOD活性仅为0 d的43%。

2.4 不同老化处理时间对棉花种子相对电导率的影响

由图4可知，随着老化处理程度的加深，种子幼苗的相对电导率缓慢增加。在老化处理前期，老化种子的相对电导率变化较小，从老化处理开始后显著升高，老化处理8 d和12 d的相对电导率分别是对照的1.9倍和2.1倍。经过不同梯度差异处理后，相对电导率呈慢慢增加的趋势。说明随着梯度处理时间的延长，种子细胞膜的膜质超氧化一直加强，细胞的系统受到的破坏逐渐加重，细胞结构系统的完整性越来越差，膜的渗透性增长，造成细胞内的物质大量外渗，导致种子生命力下降。

图2 不同老化处理时间对棉花种子POD活性的影响

图3 不同老化处理时间对棉花种子SOD活性的影响

图4 不同老化处理时间对棉花种子相对电导率的影响

3 结论与讨论

种子生活力是反映种子潜在发芽率的能力，它与种子的发育、贮藏以及萌芽等生理活动密切相关，生产上常以发芽率、发芽势、发芽指数来测定种子的生活力。在自然条件下，种子的生活力会随着保存时间的延伸而下降。张玲丽等在不同类型小麦品种人工老化处理后种子活力特性的研究中表明，模拟老化处理条件下植株活力的衰退先于植物生命力，表现为发芽速率明显减慢，生活力降低[6]。 本研究结果表明，随着人工老化处理程度的加深，种子的发芽率、发芽势、发芽指数均呈下降的趋势。这与乔燕祥等[7]在花生种子人工老化对萌发期种子活力的影响研究的结果一致。

种子老化首先起始于种子细胞结构的破坏，结构的破坏引起细胞的渗透性增加，表现为物质和代谢渗透量的加大，其中包括游离离子、可溶性糖、各种蛋白质等，同时还有一定量的固定的气体物质释放，引起种子浸出液的相对导电率上升[8]。韩熠等关于人工老化处理对高粱种子萌发及生理生化特性的影响研究中表明，不同高粱种子MDA拥有量跟着处理时间的增加呈上升趋势，并且与对照相比差异达显著水平[9]。这与本研究的结果相符。孙春青等的研究表明，随着老化处理时间的加深，甘蓝种子MDA含量呈现先增加后逐渐下降的趋势[10]。这与本研究的结果有些不同，这可能与老化种子的特性有关。本研究发现，随着老化处理时间的增加，种子幼苗中的MDA含量在老化处理前期变化缓慢，而后变化较为迅速，在老化处理后期MDA含量的变化又变为缓慢，这种慢快慢的变化与种子的发芽指标变化相符合。

老化引起的植物细胞膜的破坏必然会涉及到细胞膜上各种酶的活力，本研究通过测定老化幼苗中SOD、POD活性发现，伴随老化处理间隔的增加，SOD、POD 2种酶的活性整体上呈现下降的趋势。这与罗布麻[11]和大麦[12]种子老化过程中的生理生化特性中的结果相一致。在老化处理前2种酶的功能变化很小，这可能是在时间的老化处理中，棉花种子自身具有修复一些酶活性的能力，在老化处理后期2种酶的功能都出现急剧下降，这可能是种子的细胞结构遭到破坏，种子自身的修复能力远远低于种子损伤的能力。随着损伤的加大，SOD、POD活力迅速下降，SOD、POD 2种酶消除细胞中自由移动基的功能下降，造成细胞中游离的自由基含量增加，游离的自由基损伤细胞的膜系统，造成植物质膜的完全性遭到损伤，种子的生活力下降。

植物细胞完整性的破坏致使细胞的选择通过性降低，细胞中的水溶性物质大量外渗，此时如果把植物组织放置在去离子水中，一段时间后去离子水的导电性将因水溶性物质的外渗而增大。细胞完整性损伤越严重向外泄露物质越厉害，电导率的上升也就越高，故可根据外液电导率的上升值来推测植物完整性的损伤大小[13]。在高粱[9]、罗布麻[11]、小麦[14]和烟草[15]等作物中均发现随着老化处理的加深，浸出液的电导率都呈现上升的趋势。本研究通过测定老化种子幼苗的相对电导率，发现棉花种子在老化过程中电导率也有上升的趋势，但棉花种子的相对电导率上升的趋势很慢，这可能与棉花种子具有坚硬致密的外壳，种籽富含油脂物质有关。

种子老化过程的机理是一个多样性的过程，它关系到种子的发芽指标和幼苗细胞膜的完整性，以及膜上酶的活性[16]。本研究通过测定种子的萌发指标、SOD、POD活性以及相对电导率对棉花种子老化的生理生化有初步的阐明，而对种子老化机理的具体过程及机制还有待从分子方面做更进一步的研究。

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