GC-MS法测定血中1-甲基海因含量及其法医学应用

（中国医科大学法医学院，辽宁 沈阳 110013）

死后生物化学检查是法医学鉴定中重要的检查手段[1-4]。肌酐是临床上常用的生化学检测指标，也是反映代谢紊乱和肾功能的主要指标，对法医学应用具有一定的指导意义。而肌酐的中间代谢产物1-甲基海因（1-methylhydantoin，1-MH）是新近发现的尿毒症毒素，其化学结构见图1。有研究[5-8]表明，尿毒症患者血中1-甲基海因明显高于正常人，且1-甲基海因为细菌分解肌酐后的产物，可结合肌酐、尿素氮含量评价肾功能，故其也可作为生化学检测物质应用于法医学鉴定。有报道[9]采用高效液相色谱（HPLC）法对蛤蟆油中1-甲基海因进行测定，而血中1-甲基海因含量测定少有报道。本研究拟采用气相色谱-质谱（GCMS）法测定血中1-甲基海因含量，以期对相关领域工作提供参考。

图1 肌酐（A、B）及1-甲基海因（C）化学结构

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）。

1-甲基海因标准品购自上海一研生物科技有限公司，纯度＞99.5%。盐酸双苯戊二氨酯（SKF525A）标准品购自美国Sigma-Aldrich公司，纯度＞95%。甲醇为色谱纯，环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷均为分析纯。

1.2 溶液配制

1-甲基海因标准液：精密称取10 mg 1-甲基海因标准品，用蒸馏水配制成质量浓度为1mg/mL的溶液。 然后用蒸馏水逐级稀释为 50、10、5、1、0.5 ng/mL的1-甲基海因标准溶液。

内标SKF525A溶液：准确称取SKF525A标准品10mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，得1 mg/mL的内标溶液，然后用甲醇稀释为100 μg/mL的工作液。

1.3 方法

1.3.1 仪器条件

选用 Rtx-5 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），初始柱温60℃，保持1min，以20℃/min升温至260℃，保持11min，总分析时间为22min。进样口温度265℃，接口温度260℃，离子源温度230℃。扫描范围m/z 35～450。载气为氦气，流速1.0mL/min，采用电子轰击式离子源。

1.3.2 样品前处理

取待测血液0.5mL，加入5μL内标、2mL 0.01mol/L稀盐酸溶液，振荡2min，再加入碳酸铵0.5g调节pH值为9。加入2mL乙酸乙酯，振荡2min，之后以离心半径5cm，4000r/min，离心10min。吸取上层有机溶剂，用氮气吹干至100μL。取1μL用于GC-MS进样。

1.3.3 工作曲线、最低检出限、线性范围

按1.3.2节操作，每份样品平行测定3次，以1-甲基海因的质量浓度为自变量（x），1-甲基海因与内标峰面积的比值为因变量（y），绘制标准曲线。以信噪比的2倍为最低检出限，以信噪比的10倍为最低定量限[10]。

1.3.4 精密度和回收率

取添加1-甲基海因低、中、高3个质量浓度（分别为 0.5、5、50 ng/mL）的血液，按照 1.3.2 节处理，每个质量浓度重复提取3次，计算每个质量浓度样品的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）作为日内精密度。连续测定5d，计算每个质量浓度样品的RSD作为日间精密度。

2 结 果

2.1 GC-MS检测

1-甲基海因和内标得到了很好的分离，色谱峰尖锐。血液中1-甲基海因和内标的保留时间分别为6.922min 和 13.279min（图 2）。

图2 血液中1-甲基海因和内标的GC-MS图

2.2 工作曲线、线性范围和最低检出限

结果显示，1-甲基海因在0.5～50ng/mL范围内线性关系良好，回归方程为y=0.015 51 x+0.007 26（R2=0.9997），最低检出限为 0.1ng/mL。

2.3 精密度和回收率

1-甲基海因的精密度和回收率结果见表1。

表1 1-甲基海因的精密度和回收率 （%）

2.4 案例应用

杨某，男，41岁，被人攻击头部死亡。尸表检查：瞳孔散大，面部左侧散在点片状淡红色皮下出血，右额部片状淡红色皮下出血。尸体解剖：切开头皮见帽状腱膜下20cm×22cm范围广泛出血，左侧颞肌4cm×5 cm范围出血，左颞顶部7 cm×10 cm范围呈粉碎性骨折，顶部有一骨折线，向右颞部延伸，长10cm；锯开颅骨见左颞部硬脑膜破裂，硬脑膜下血肿达14 cm×9 cm×6 cm，蛛网膜下腔出血；肾表面凹凸不平，包膜难以剥离，切面皮髓质分界不清，皮质明显萎缩、变薄，双肾实质内多个细小囊肿，直径最大为3 mm，未见挫伤及结石。组织病理学检验：较多肾小球纤维化，邻近的肾小管萎缩、消失，间质纤维组织增生，淋巴细胞浸润，存活的肾小球及肾小管代偿性肥大，部分区域可见血肿及浆液性囊肿结构。死者生前生化检验结果显示血肌酐 1 756 μmol/L，尿素氮 76.3 mmol/L，是名尿毒症患者。经本研究建立的方法从血样中检测出1-甲基海因，含量为8.78ng/mL。

3 讨 论

3.1 萃取环境的考察

本研究前期考察了pH=2（0.01 mol/L稀盐酸溶液）、pH=7（pH=7 的蒸馏水溶液）、pH=9（0.01mol/L 稀盐酸溶液，振荡2 min，加入0.5g碳酸铵调节pH值为 9）、pH=12（0.01 mol/L的氢氧化钠溶液）情况下的萃取情况，结果显示在pH=9的条件下萃取效率最高。可能是由于1-甲基海因属于生物碱，虽然其结构中有酰亚胺结构，但整体呈弱碱性。

3.2 萃取溶剂的考察

本研究前期考察了3种萃取溶剂，按照极性大小依次为二氯甲烷、乙酸乙酯、环己烷，其中乙酸乙酯作为萃取溶剂时，萃取效率最高。由于1-甲基海因属于中等极性物质，所以依据相似相溶原理，中等极性的萃取溶剂乙酸乙酯相对理想。

3.3 结论

肌酐具有一定的稳定性，是临床上用于评价肾功能的主要指标，尿毒症患者会出现肌酐含量升高。而1-甲基海因是肌酐代谢的中间产物，由肌酐在尿毒症患者的胃肠道内经过肌酐脱氨酶形成后再进入人体[11]，因1-甲基海因在正常组织中检测不到，在炎症组织中可检测到[12]，故可结合肌酐、尿素氮含量评价肾功能。本案中，该名死者存在肾病，肌酐含量高于正常值（44～133 μmol/L），亦在死者血样中检测出肌酐的代谢产物1-甲基海因，所以1-甲基海因的测定对尿毒症患者相关法医学鉴定具有一定的指导意义。

[1]高卫民，朱吉林，米丽，等.尿素氮、肌酐和尿酸死后生化学检测的法医学应用[J].中国法医学杂志，2013，28（4）：297-299.

[2]ZHU B L，ISHIDA K，QUAN L， et al.Postmortem serum uric acid and creatinine levels in relation to the causes of death[J].Forensic Sci Int，2002，125（1）：59-66.

[3]ZHU B L，ISHIKAWA T，MICHIUE T，et al.Evaluation of postmortem urea nitrogen，creatinine and uric acid levels in pericardial fluid in forensic autopsy[J].Leg Med （Tokyo），2005，7（5）：287-292.

[4]UEMURA K，SHINTANI-ISHIDA K，SAKA K，et al.Biochemical blood markers and sampling sites in forensic autopsy[J].J Forensic Leg Med，2008，15（5）：312-317.

[5]杨波，王志娣，蒋云生，等.普罗布考对1-甲脲乙醇酸酐诱导HK-2细胞表达纤维化相关因子的影响[J].中南医学科学杂志，2011，39（4）：390-394.

[6]IENAGA K，YOKOZAWA T.Creatinine and HMH（5-hydroxy-1-methylhydantoin， NZ-419） as intrinsic hydroxyl radical scavengers[J].Drug Discov Ther，2011，5（4）：162-175.

[7]曾斌元，颜天铭，杨波.前列腺素E1对1-甲脲乙醇酸酐所致肾小管上皮细胞损害的保护作用[J].医学临床研究，2012，29（8）：1491-1493.

[8]杨波，邓薇，蒋云生，等.肌酐代谢产物对人肾小管上皮细胞毒性作用的比较研究[J].中国医师杂志，2011，13（6）：738-741.

[9]王永生，张辉，林喆，等.RP-HPLC测定哈蟆油中1-甲基海因的含量[J].中国药学杂志，2008，43（2）：146-148.

[10]杭太俊，于治国，范国荣.药物分析[M].7版.北京：人民卫生出版社，2011：167-168.

[11]YANG B，LIU D，LI C Z，et al.1-Methylhydantoin cytotoxicity on renal proximal tubular cells in vitro[J].Ren Fail，2007，29（8）：1025-1029.

[12]IENAGA K，NAKAMURA K，NAKA F， et al.The metabolism of1-methylhydantoin via 5-hydroxy-1-methylhydantoin in mammals[J].Biochim Biophys Acta，1988，967（3）：441-443.