卵母细胞质量的影响因素

蔡娇娇 陆文昊 杨欢利 李真法 诸溢扬

台州恩泽医疗中心(集团)浙江省台州医院(317199)

高质量的卵母细胞是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功的重要前提。卵母细胞质量除了受妇女年龄、超排卵治疗的影响外，还受到颗粒细胞功能和子宫内膜异位症等因素的影响。随着现代分子生物技术的发展，越来越多专家学者开始从细胞水平和分子水平进一步阐述这些影响因素的作用机制。

1 年龄的影响

随着女性年龄的增加，获卵数和卵母细胞质量都明显下降，妊娠率降低，流产率升高。Wright等[1]统计发现<35岁女性ET后临床妊娠率高达46%，35～37岁下降至23%，而>42岁则只有4%。研究发现卵巢储备功能下降的同时，卵母细胞非整倍体增加，荧光原位杂交的方法测定>35岁妇女卵子的第一、二极体中的13、18、21和性染色体，发现非整倍体的发生率分别为21.8%和20.3%[2]。除了染色体层面的异常，随着年龄的增长，卵胞质中线粒体、皮质颗粒等细胞器相应减少，高龄妇女(≥38岁)比年轻妇女的5kb线粒体DNA缺失率增高3.3倍[3]，此外，年龄也影响了颗粒细胞和卵泡液，通过改变卵母细胞外的微环境间接导致卵子质量发生变化[4]。新的研究发现，一些调控DNA转录的非编码RNA往往因年龄和(或)卵巢储备而差异表达。有趣的是，体内成熟卵的mRNA转录组在年龄和卵巢储备不同情况下仍非常稳定，说明改变发生在非编码转录组，其可能调控某些转录或转录前机制来影响卵子发育潜能[5]。

线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，在减数分裂及有丝分裂过程中位于纺锤体附近，为中心体、细胞骨架、染色体活动提供能量，ATP含量的减少可以干扰纺锤体上微管蛋白的聚合和解聚，从而影响染色体分离，导致非整倍体的产生[6]。受精过程是一个耗能过程，卵浆ATP含量下降引起能量代谢异常，ATP含量低的卵子也能受精和早期分裂，仅当ATP含量≥2pmol时，受精的卵子才容易着床和继续发育[7]。此外，研究还发现高龄患者卵母细胞中的端粒长度明显短于年轻患者卵母细胞，端粒酶活性也相对较差，端粒变短会影响同源染色体联会、减数分裂，导致非整倍体的出现[8]。从本质上说，年龄对卵母细胞质量的影响主要源自线粒体、端粒等结构和功能的变化，继而影响胚胎后续发育潜能。

2 颗粒细胞的作用

卵泡的生长发育是卵子、周围颗粒细胞和卵泡膜细胞相互作用的共同结果。在卵泡生长过程中，颗粒细胞由扁平单层变成柱状复层，合成并分泌包围卵母细胞的黏多糖从而形成透明带，与卵母细胞形成缝隙连接，进行细胞间营养及小分子物质交换、信息传递[9-10]。自次级卵泡至形成卵泡窦腔，颗粒细胞分化成壁层颗粒细胞和包绕卵母细胞的卵丘细胞。缝隙连接的基本单位是连接蛋白，卵丘细胞通过缝隙连接切断外层卵丘细胞减数分裂抑制信号从而恢复减数分裂，研究表明连接蛋白43的减少在其中有着重要影响[11]。在卵母细胞成熟过程中，卵冠丘复合物的很大一部分葡萄糖通过糖酵解途径提供能量和底物，葡萄糖浓度的过高或者过低都会导致细胞核-细胞质成熟的不同步[12]。此外，卵丘细胞分泌的小分子物质如cAMP、三磷酸肌醇、Ca2+、氨基酸等通过缝隙连接进入卵母细胞内并调节卵母细胞生长与成熟[13]。卵子成熟后，卵丘细胞上的前列腺素E2受体对前列腺素E2产生应答，继而决定卵泡破裂的位置[14]。

此外，活性氧(ROS)过剩会引起细胞结构的损坏，如脂类、细胞膜、蛋白和DNA损伤。活性氧自由基不仅参与信号转导、启动有丝分裂、防御病原体，他的另一个生理机能是参与卵泡发育、卵母细胞成熟、排卵、黄体功能及卵泡闭锁[15]。早在1993年，褪黑素(MT)就被发现是自由基的强有力清除者，它是一种由哺乳动物和人类松果体产生的胺类激素，存在于全身各组织细胞，在窦卵泡的卵泡液中，其浓度是血清浓度的3倍，MT自身结构稳定，不易发生自氧化，且和自由基相互作用后的代谢产物仍是强有力的抗氧化物质。MT受体(MR)有3种亚型(MR1、MR2、MR3)，研究发现人颗粒细胞的细胞膜中可检测到MR1和MR2，也就是说颗粒细胞可以通过MR识别MT，从而减少活性氧对卵母细胞的伤害，最近的研究发现颗粒细胞不仅能识别褪黑素，同时还能产生褪黑素[16]。除此之外，卵泡局部产生的生长因子，如胰岛素样生长因子(IGF-I)能促进有丝分裂并起到抗凋亡的作用，MT可通过颗粒细胞上的受体刺激其产生IGF-I，从而激活下游信号通路，参与细胞生长、分化和代谢[17]。但是颗粒细胞代谢增强会导致产生大量ROS，反过来导致颗粒细胞促性腺激素和类固醇生成功能丧失，使相应卵子失去颗粒细胞的调节功能，从而影响其受精、卵裂及后续的胚胎发育过程[18]。颗粒细胞转录组学基因表达谱的研究发现有差异表达的基因涉及到卵母细胞的不同功能。可见，保持颗粒细胞功能的正常运行对卵母细胞生长发育及后续胚胎的发育有着至关重要的作用。

3 控制性超促排卵的利与弊

控制性超排卵(COH)是一个超生理卵泡募集、发育、排卵的过程，其实质是延长FSH的阈值窗，募集更多的卵泡发育。这一过程是不完全同步的，要克服不同步因素才有可能获得质量与自然周期主导卵泡一样的优质卵子。目前国内常用的几种促超排卵方案有促性腺释放激素激动剂(GnRH-a)长方案、短方案以及长效GnRH-a方案，其他还有拮抗剂方案及微刺激等。早在1986年临床试验已证明卵泡发育早期的黄体生成素(LH)峰会降低卵子质量，影响胚胎发育，降低妊娠率[19]。国内外诸多研究也证实GnRH-a长方案对下丘脑有效降调节可保证卵泡发育的同步性，提高卵子质量；而长方案组绒毛膜促性腺激素(hCG)注射日LH水平显著低于短方案组，这也就说明长方案促排卵过程中对LH水平的调控影响了卵母细胞质量[20]。前文已提到IGF-I是一种细胞增殖调控因子，在卵泡募集、生长和闭锁等方面均发挥了重要作用。已有研究报道GnRH-ant方案hCG日血清、取卵日血清及卵泡液中IGF-I水平均高于GnRH-a方案，卵母细胞成熟度也明显提高，说明拮抗剂的使用提高了IGF-I水平，而IGF-I协同促进了卵母细胞成熟[21]。

当然，超促排过程中外源性Gn的使用并非对卵子没有伤害，有报道认为卵母细胞代谢异常、ATP含量下降、核/质成熟不同步、微管混乱等变化很可能是因为外源性促性腺激素在非生理状态下虽然促进了多个卵泡的生长发育，但也损害了线粒体功能，影响了细胞骨架结构[22]。此外，促排卵过程中棕色卵子透明带色泽改变，与促排卵中使用卵泡刺激素(FSH)与血清FSH浓度有关，血清高浓度FSH可能造成透明带颜色异常，最终导致胚胎发育潜能低下[23]。在临床COH过程中，促排卵药物的使用导致体内各项激素水平发生改变，同时部分生长激素的分泌发生变化导致卵母细胞质量受到影响。为获得高质量的卵子和胚胎以及更好的子宫种植环境，掌握促排卵药物的适当剂量以及用药时间是非常重要的。

4 子宫内膜异位症的影响

子宫内膜异位症(EM)是一种复杂的炎性疾病，影响了10%～15%的育龄妇女，其对生育能力造成的损害是多方面的，包括卵巢功能改变、盆腔粘连、腹腔内环境异常、子宫内膜异常和卵泡发育异常等，其中卵泡发育异常、卵母质量下降是导致不孕的主要原因之一。相比于其他原因不孕患者，EM患者卵泡生长速度减慢，受精率和妊娠率明显下降，并伴有较多空卵泡和卵泡闭锁发生[24]。新的研究发现子宫内膜异位症患者成熟卵数和正常形态卵子数显著降低，此外，I～IV期子宫内膜异位症患者褐色卵增加，IV期患者比I～III期患者卵子质量更差[25]，颗粒细胞相对更易凋亡脱落，透明带硬度变大[26]。

到目前为止，EM的发病机制尚不明确，有学者认为免疫功能紊乱是其导致不孕的重要原因。腹膜炎症微环境改变，包括激素水平失衡、氧化应激反应等都会引起卵母细胞和胚胎质量变差。研究发现EM患者卵泡液环境比其他不孕患者易导致更大的氧化应激，引起活性氧自由基大量产生，继而引起卵母细胞损伤，而受损的子宫内膜则直接导致胚胎着床失败[27-28]。

研究表明，EM患者体内卵泡液中T淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核巨噬细胞比例增加，T细胞表达分泌的T细胞激活性低分泌因子(RANTES) 显著增加，而单核细胞趋化蛋白1 ( MCP-1) 则明显减少，这两种趋化因子均能反映免疫系统的局部调控作用[29]。事实上，EM患者相对于输卵管性不孕患者妊娠率低、流产率高的结局，似乎也印证了免疫功能紊乱引起的卵泡液微环境改变导致卵母细胞及胚胎受损的结论。同时，血管内皮生长因子、白介素、肿瘤坏死因子在EM患者卵泡液中的增加也扰乱了颗粒细胞正常细胞周期，对卵泡形成产生病理性作用，同时颗粒细胞内部芳香化酶活性和孕激素降低，合成类固醇激素的能力变差[30]。因此，EM患者卵母细胞质量受到多方面的共同作用，目前尚未有定论，专家学者对此观念也不一致，本文更多倾向于免疫功能紊乱起到更大的影响。

综上所述，影响卵母细胞的因素是多方面的。虽然学者们对卵母细胞评估在辅助生殖技术中的应用做了大量的研究，但每个具体的卵子异常特性对胚胎发育、妊娠结局的影响仍存在争议。辅助生育技术迅速发展，如何得到高质量的胚胎和高临床妊娠率一直是关注的焦点，了解卵母细胞质量的影响因素，通过新技术手段改善卵母细胞质量，从而提高胚胎的发育能力，获得最具着床潜能的胚胎意义重大。

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