蛤蚧不同提取液对衰老模型小鼠免疫功能的影响

吴丽丽 周 蓓 陈 豪 冯丽婷 何金桂

蛤蚧(GekkogeckoLinnaeus)为脊索动物门爬行纲壁虎科动物，又名蛤蟹、仙蟾、蚧蛇、大壁虎、德多等，首载于《雷公炮炙论》，《本草纲目》记载：蛤蚧咸性平、归肺、肾经，具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精的功效，用于虚喘气促、劳嗽咳血、阳痿遗精。蛤蚧具有多方面的药理作用，而现代研究多以对其原药材的醇提物进行分析，如林安平等[1]研究表明蛤蚧乙醇提取液能显著提高IGF-1和Inh A在大鼠卵巢中的表达，从而改善大鼠卵巢功能。张胜昌等[2]研究表明蛤蚧乙醇提取液可能诱导骨微环境中TGF-β1表达增加，有效预防绝经后骨质疏松的发生。此外，多项研究表明[3～6]，蛤蚧对环磷酰胺诱导免疫功能低下小鼠、荷瘤小鼠具有抑瘤、提高免疫等作用。但鲜少见有关于蛤蚧对衰老模型小鼠免疫功能影响的报道，因此本实验通过观察蛤蚧乙醇提取液以及仿生酶解液对D-半乳糖(D-gal)诱导衰老小鼠免疫功能的影响，以期为进一步研究蛤蚧增强机体免疫、延缓衰老提供依据。

1.材料

1.1 药材 蛤蚧干燥体，购买于玉林药材市场，经广西中医药大学中药鉴定教研室田慧教授鉴定其为壁虎科动物蛤蚧(Gekko gecko Linnaeus)。清理蛤蚧表面灰尘，去掉头部，置干燥箱内60℃烘干后，用粉碎机进行粉碎，使全部蛤蚧粉末能通过二号筛，混合均匀，备用。

1.2 动物 清洁级2～3月龄昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK桂2016-0504。实验小鼠进入动物房适应3天后开始实验。动物饲养环境符合SPF实验动物级环境设施标准，实验室按昼夜节律采光12小时，通风良好，室温保持在20℃～25℃左右，定期消毒。

1.3 仪器 中草药粉碎机(型号：LD-500，天津市泰斯特仪器有限公司)；电热真空干燥箱(型号：DZF-6000系列，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；超声波清洗器(型号：KQ5200B，昆山市超声仪器有限公司)；精密电子天平(型号：SQP，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；电热恒温水浴锅(型号：DKS-26，上海精宏实验设备有限公司)；离心机(型号：TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)；微孔板检测仪(型号：Infinite M200 PRO，帝肯(上海)贸易有限公司)。

1.4 试剂 D-半乳糖(Sigma公司，批号：G6404)，胃蛋白酶(1:3000，Amresco公司，批号0685)，胰蛋白酶(1:250，Amresco公司，批号：B0016K040100)，维生素E软胶囊[国药控股星鲨制药(厦门)有限公司，批号：10853003]，IL-2试剂盒(Bio-Swamp公司，批号：201606)，其余所用化学试剂、药品均为分析纯，水为超纯水。

2.方法

2.1 药液的制备 ①蛤蚧乙醇提取液：精密称取蛤蚧粉末40.5g，加入20%乙醇溶剂1000ml，置于超声波清洗器中，超声温度为35℃，超声60分钟后过滤上清液，残渣再加相同体积的溶剂进行超声，合并所得上清液，然后浓缩至65ml，即为蛤蚧乙醇提取液。②蛤蚧仿生酶解液[7]：精密称取蛤蚧粉末40.5g，放入1000ml烧杯中，加入1000ml的蒸馏水，在40℃下水浴提取15分钟，用稀盐酸调节pH值为2.0，在37℃下水浴保温10分钟后加入1%胃蛋白酶，在37℃下酶解2小时，然后加热到65℃将酶灭活；然后用NaOH调节pH值为8.0，在50℃下水浴保温10分钟后加入1%胰蛋白酶，在50℃下酶解3小时，然后加热到65℃将酶灭活。在酶解液冷却至室温后，过滤，浓缩至65ml，即为蛤蚧仿生酶解液。③维生素E：取维生素E 50mg，溶于10ml食用油中制成浓度为5mg/ml的溶液，备用。

2.2 分组与给药 将50只小鼠随机分成正常对照组、模型对照组、维生素E组、乙醇提取液组、仿生酶解液组，共5组，每组10只。正常对照组按0.1ml/10g颈背部皮下注射0.9%生理盐水，其余各组小鼠按120mg/kg、给药剂量0.1ml/10g颈背部皮下注射D-gal，每日1次，连续注射6周。造模后，正常对照组和模型对照组灌胃等体积0.9%生理盐水，维生素E组、乙醇提取液组和仿生酶解液组按0.1ml/10g分别灌胃对应药液，连续给药21天。实验期间小鼠自由进食、进水，每3天称重1次，按体重调整给药剂量。

3.检测指标及检测方法

3.1 小鼠脾脏和胸腺指数测定 摘眼球取血前，准确称定各组小鼠的体重，摘取眼球取血后颈部脱臼处死，摘除脾脏和胸腺，用预冷的生理盐水反复冲洗，用滤纸吸干，用电子天平称其重量，计算各脏器指数。脏器指数=脏器质量(mg)/小鼠体重(g)。

3.2 检测小鼠血清中细胞因子IL-2浓度 取血后，自然静置30分钟，然后以3000r/min离心10分钟，取上清液即为血清，再按ELISA试剂盒说明书操作，测定血清中细胞因子IL-2的浓度。

4.结果

4.1 小鼠一般行为学观察 实验期间每天观察小鼠一般行为改变，包括进食、活动、毛色改变等情况，并每隔3天称小鼠体重1次，观察各组小鼠体重变化情况。连续皮下注射D-gal 6周，小鼠毛色逐渐枯槁没光泽，皮肤弹性变差，精神萎靡，活动减少，倦怠嗜睡，进食减少，饮水量下降，体重减轻，呈现出衰老体征。如表1可知，各组小鼠初始体重无明显差异(P>0.05)；连续皮下注射D-半乳糖6周后，与正常对照组相比，其余各组小鼠的末次体重和增重均显著降低(P<0.05)。

4.2 蛤蚧不同提取液对D-gal诱导衰老小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响 结果见表2，与正常对照组比较，模型对照组小鼠脾脏指数、胸腺指数均降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，维生素E组、乙醇提取液组、仿生酶解液组脾脏指数、胸腺指数均升高，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，而各给药组之间无明显差异(P>0.05)。

表1 D-gal诱导衰老小鼠体重变化(n=10)

注：与正常对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

表2 各组小鼠脾脏和胸腺指数比较

注：与正常对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与模型对照组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

4.3 蛤蚧不同提取液对D-gal诱导衰老小鼠细胞因子IL-2的影响 结果见表3，与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清中IL-2水平显著下降(P<0.01)；与模型对照组比较，维生素E组和仿生酶解液组小鼠血清中IL-2水平均升高，并具有统计学意义(P<0.05)，但两组之间无显著性差异(P>0.05)；乙醇提取液组血清中IL-2水平有一定程度的提高，但不具有统计学意义(P>0.05)。

表3 各组小鼠血清细胞因子IL-2的水平(n=10)

注：与正常对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与模型对照组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

5.讨论

免疫衰老学说作为衰老机制的经典学说之一，认为免疫系统是衰老过程的主要调节系统之一，最初在于增龄导致的胸腺萎缩，进一步导致机体细胞免疫、体液免疫以及天然免疫发生不同程度的改变[8]。胸腺作为机体的中枢免疫器官，是各种T细胞分化成熟的场所，其功能状态的正常与否，直接关系到到机体整体免疫情况的好坏。而脾脏作为人体最大的外周免疫器官，有大量的淋巴样组织产生淋巴细胞和单核细胞，其次脾脏还是机体的“血库”，能储存体内的血液以及发挥滤血的作用，主要是脾内有许多吞噬细胞能够清除经过脾内血液中的衰老血红细胞，从而参与机体免疫机制。IL-2是一种在机体的免疫调节中发挥着重要而复杂作用的细胞因子，既可促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制T细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于治疗肿瘤和感染性疾病及自身免疫性疾病[9]。因此通过测定小鼠胸腺指数、脾腺指数和IL-2来指示小鼠的免疫功能。

D-半乳糖诱导衰老模型由于其操作简便、造模时间较短、模型易于建立、重复性好等优势，且表现出与自然衰老动物相似的衰老体征，已成为国内较公认的衰老模型。曹湘博等[10]研究表明，给小鼠皮下注射D-半乳糖40mg/(kg·d)，连续给药10天，其胸腺指数、T细胞增殖活性以及IL-2，IFN-γ，TNF三种TH1型细胞因子活性均明显低于正常对照组，表明D-半乳糖可诱导小鼠免疫功能降低。董会萍[11]对D-半乳糖诱导衰老小鼠的剂量进行筛选实验，结果表明，在120～150mg/(kg·d)剂量范围，D-半乳糖能够引起抗氧化酶系统活力的下降，同时造成实验动物空间认知能力的损伤，而低剂量75mg/(kg·d)作用不明显。此外，高剂量条件[1000mg/(kg·d)]虽然也能够引起上述生理、生化和行为改变，但是在该剂量条件下，实验动物免疫力明显下降，死亡率较高，且自主活动减少，不利于认知、情绪相关的行为学实验的进行及结果的判定，因此选择120～150mg/(kg·d)作为建立D-半乳糖衰老动物模型的合理剂量范围。

中医认为，肾为先天之本，藏先天之精，主生殖，为人体生命之本原。肾阳为一身阳气之本，能推动和激发脏腑的各种机能，温煦全身脏腑形体官窍。因此，认为蛤蚧可通过补肾、助阳益精的功效达到延缓机体衰老的目的。罗谋伦等[12]研究表明蛤蚧乙醇提取物可延长雌雄果蝇的平均寿命及半数死亡时间，提高雌雄果蝇飞翔活力及耐寒力，延长小鼠的缺氧存活时间，证实蛤蚧具有一定的抗衰老作用。薛长江等[13]研究表明蛤蚧醇提液能显著提高18月龄衰老大鼠心肌组织自由基清除能力达到延缓衰老的作用。

现代研究认为，蛤蚧具有抗炎、平喘、抗应激、免疫调节、抗衰老等方面的作用主要与蛤蚧体内含有大量的功能蛋白密切相关。而随着现今对蛋白质类药物的研究，多集中在将大分子蛋白质变成分子量较小的多肽，从而寻找活性中心，以达到更好的药效。而仿生酶解法是先通过胃蛋白酶酶解，再经过胰蛋白酶酶解，模拟人体消化过程，可使蛤蚧中的蛋白质类成分酶解成小分子肽，能提高蛤蚧中物质基础的溶出率。因此，本试验比较研究乙醇提取和仿生酶解蛤蚧对D-半乳糖诱导衰老小鼠免疫功能的影响。实验结果表明，蛤蚧的仿生酶解液和乙醇提取液均能提高D-半乳糖诱导衰老小鼠的脾脏指数、胸腺指数以及血清中IL-2水平，且仿生酶解液增强免疫作用优于乙醇提取液，提示蛤蚧通过仿生酶解法提取，可有效提高蛤蚧多肽溶解率，进而显著增强机体免疫功能，为进一步研究蛤蚧延缓衰老的机制提供借鉴。

1 林安平，胡丽娜，李聪.蛤蚧乙醇提取液对大鼠卵巢颗粒细胞影响的实验研究[J].儿科药学杂志，2007，13(3)：13-15,21.

2 张胜昌，白鹭，蓝玲，等.蛤蚧乙醇提取液影响去势大鼠胫骨TGF-β1表达的研究[J].广西医科大学学报，2010，27(2)：191-194.

3 席玮，谢裕安，杨帆，等.蛤蚧肽对荷瘤小鼠的免疫调节及抗肿瘤作用[J].内科，2011，6(1)：5-8.

4 杨帆，席伟，谢裕安，等.蛤蚧肽对小鼠免疫功能的调节作用[J].广西医科大学学报，2011，28(3)：342-344.

5 周蓓，陈豪，吴丽丽，等.蛤蚧对S(180)荷瘤小鼠Th1/Th2免疫细胞平衡的影响[J].亚太传统医药，2016，12(9)：11-13.

6 蛤蚧对S180荷肉瘤小鼠的抑瘤作用及对免疫系统的影响[J].哈尔滨医科大学学报，2005，39(5)：402-404.

7 李钦青，孙明江，代龙，等.壁虎不同提取工艺成分抗肿瘤作用的研究[J].时珍国医国药，2010，21(7)：1629-1630.

8 史进方，顾国浩，张学光.免疫衰老及其免疫学预警指标[J].现代免疫学，2005，25(4)：347-349.

9 常瑞雪，颜天华，王秋娟，等.白细胞介素-2及其相关药物的应用研究进展[J].药学进展，2011，35(1)：1-7.

10 曹湘博，于乐洋，常雅萍.D-半乳糖亚急性中毒拟衰老模型鼠免疫功能及生化指标变化的研究[J].中国比较医学杂志，2007，17(7)：382-385.

11 董会萍.D-半乳糖衰老模型建立及模型小鼠认知功能障碍的研究[D].大连理工大学，2008.

12 罗谋伦，谢干琼，赵一.蛤蚧抗衰老作用的实验研究[C].全国抗衰老药物学术年会资料汇编，1990：98-103页.

13 薛长江，周小棉，陈国千，等.蛤蚧对大鼠心肌抗衰老作用的影响[J].中药药理与临床，1992，8(2)：21-24.