新辅助化疗对大肠癌肿瘤细胞凋亡的影响

吕国利 白 松 李 杨

大肠癌(CRC)是常见的下消化道恶性肿瘤，据权威统计2007全年世界各国新发患者数约为110余万，死亡病例高达60余万，居所有人体恶性肿瘤的第3位[1]。中国每年新发大肠癌患者超过15万，死亡比例达到17.4/10万人[2]，发病比率高居全国所有人体罹患恶性肿瘤的第4位[3]，且死亡比率位居第五[4，5]。随着中国居民生活方式、饮食习惯及工业化进程不断变化，全国大肠癌患者发病比率大幅度上升，截至21世纪的前十年间，中国城镇居民发病率上升超过31%，而在乡村上升超过17%[6]。外科手术仍然是大肠癌的首要治疗手段，随着近些年新一代化疗药物不断更新及术后化疗方案的更新换代,已经为改善大肠癌患者预后及带瘤生存质量带来了新的福音。但是，大肠恶性肿瘤的复发率及死亡率仍居高不下。因此，新辅助化疗就成为治疗大肠癌病患的新方法。新辅助化疗(NC)是指对大肠癌患者在行根治性手术前予化疗治疗。美国国家综合癌症网络(NCCN)大肠癌临床实践指南(中国版)在2010年对大肠癌的术前化疗治疗限定在临床分期为T3并淋巴结N1、N2且不论局部浸润程度的患者，以及部分T4的晚期肿瘤患者,可通过新辅助化疗手段达到降期或降级,为完整切除肿瘤手术创造新的机会。因此,新辅助化疗在大肠癌患者治疗过程中的作用发挥较大的潜力。宋传健等[7]研究结果表明：新辅助化疗可诱导大肠癌患者的肿瘤细胞发生细胞凋亡，并可以使肿瘤组织周围血管产生炎性反应，通过使血管壁水肿、内膜增厚甚至血栓形成等方式阻断肿瘤血供，引起肿瘤组织缺血、坏死。

因而，本研究主要针对昆明医科大学第一附属医院胃肠外科2009年至2011年3年间收治的60例老年大肠癌患者，采用持续静脉泵入5-FU，LV与OXA的联合化疗方案进行术前化疗，并利用TUNEL法原位凋亡细胞染色等技术检测新辅助化疗前后肿瘤细胞凋亡的情况来评估术前化疗的临床疗效，进一步为大肠癌的治疗提供宝贵的实验室依据和评价标准。

1.资料与方法

1.1 样本 收集昆明医学院第一附属医院胃肠外科收治的60例大肠癌患者化疗前活检组织及术后病理标本，每例均经HE染色病理组织学确诊。

1.2 方法

1.2.1 TUNEL一步原位凋亡细胞检测：①用TUNEL法处理化疗前后病例切片，处理完毕后立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液，放入湿盒中于37℃反应1小时。在TdT酶反应过程中快速加入绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的d UTP(flurescein-d UTP)。②荧光显微镜下进行检测并计数。③凋亡细胞呈现绿色荧光。

1.2.2 结果判定：400倍镜下选取具有代表性的5个清晰视野，统计1000个癌组织细胞中免疫荧光凋亡的细胞总数，用百分率加以表现，即凋亡指数，以化疗前后凋亡指数差值即为AI增幅比。

1.3 统计学方法 肿瘤细胞凋亡实验数据的显著性差异分析采用方差分析及t检验来进行，对化疗前后两组数据均数间的比较先进行方差齐性检验，统计结果方差相等时再进一步采用t检验；前后两组样本率之间的比较采用确切概率法或χ2检验。各组数据用SPSS 17.0版本统计学软件来处理分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1 化疗前后凋亡指数比较 本组60例新辅助化疗后大肠癌患者的凋亡指数较化疗前均有不同程度的增高，增幅在0.3%～5.8%之间(具体见图G、图H、图I、图J)。

2.2 新辅助化疗前后肿瘤细胞凋亡指数的比较 新辅助化疗前肿瘤细胞凋亡指数最高为5.2%，最低为0.9%，平均为3.28%±1.15%，新辅助化疗后肿瘤细胞凋亡指数最高为9.3%，最低为1.4%，平均为5.37%±2.07%(前后两组配对t检验,t=-1.368，P=0.000<0.05)。因此我们认为新辅助化疗前后大肠癌的肿瘤组织细胞的凋亡指数之间存在的差异具有统计学意义(见表1)。

表1 新辅助化疗前后AI的比较

3.讨论

大肠癌是临床最为多见的损害人们健康和生命的恶性肿瘤之一。世界范围内大肠癌发病概率正以2%的年增长速度增加，在亚洲以外的欧美等国家其发病率略低于肺癌[8,9]，并且有研究者预测大肠癌极有可能成为全球发病率第一的肿瘤[10]。在亚洲和美洲，大肠癌以直肠癌为主，并且在我国具有独特的特征，年轻人直肠癌发病率较高，预后较差，且漏诊率和误诊率也很高[11,12]。经过半个多世纪对大肠癌发生机制的研究，有学者就证实其发生发展机制是一个多环节、多步骤的病理过程[13]。临床上对大肠癌的治疗以手术为主，但由于早期诊断方法的欠缺及抗肿瘤转移治疗的靶点，对于大肠癌晚期患者治疗效果较差[14]。近年，新的化疗药物及化疗方案的出现使大肠癌患者生存期的延长及生存质量的提高得到了较好的获益。即使根治性手术及全身的术后辅助化疗的临床应用,大肠癌患者的复发率及死亡率仍然比较高。所以，新辅助化疗自然成了提升大肠癌治疗效果、减少其转移、降低其复发率和病死率的新手段。

3.1 新辅助化疗药物及方案的选择 大肠癌的辅助化疗方案是以氟尿嘧啶(5-FU)为基础的。ChauI等[15]人发现，持续静脉泵入5-FU+四氢叶酸(LV)与静脉滴注方案比较疗效有显著性差异,而不良反应相对较小。近年来奥沙利铂(OXA)在大肠癌患者化学治疗中的疗效已得到广泛认可。在Ⅱ期、Ⅲ期大肠癌患者中应用FOLFOX4方案辅助化疗疗效的临床试验已在欧洲多中心随机对照试验(MOSA IC)得到了验证[16]，并在美国临床肿瘤协会(简称ASCO)2002年年会上对该方案作为辅助化疗疗效的安全性做了首次报道。随后在ASCO年会上也陆续对应用FOLFOX4方案的大肠癌患者的3年、5年无病生存率以及Ⅲ期患者中6年总生存率均优于单纯应用5-FU/LV的患者做出了详尽的报道，表现出了奥沙利铂的临床治疗价值，进一步证实了大肠癌患者术后应用FOLFOX 4方案在大肠癌患者中的优势。美国乳腺与肠道外科辅助治疗研究组(简称NSABP)在2007年的C207研究中也显示出单纯静脉应用5-FU/LV的临床疗效差于FOLFOX4方案,并且使大肠癌患者的无病生存期得到明显延长[17]。2009年美国国立综合癌症网络(NCCN)指南(中国版)对大肠癌患者的标准化疗方案推荐为FOLFOX 4方案。近年来我国已广泛应用此方案治疗大肠癌患者。因此本研究亦采用FOLFOX4方案并通过持续静脉泵入作为大肠癌患者的新辅助化疗手段。

3.2 新辅助化疗后癌组织细胞凋亡的变化 肿瘤的发生发展与人体细胞凋亡有密切关联。人为因素抑制细胞凋亡，就会使组织细胞的代谢周期延长，正常的细胞周期破坏，进而形成过度的细胞积累。凋亡率降低是肿瘤细胞长期存活的关键所在，细胞凋亡率降低将导致肿瘤的发生[18,19]。目前大部分的肿瘤治疗措施如放化疗、免疫治疗、基因治疗等均可激活癌细胞凋亡信号传导途径[19,20]。Sturm等则发现新辅助化疗能使肿瘤细胞的凋亡增加[21]。

本课题组通过对我院收治的60例大肠癌患者利用TUNEL法原位凋亡细胞染色技术对比新辅助化疗前后的癌细胞凋亡情况研究后发现：60例大肠癌患者新辅助化疗后其细胞凋亡指数相比化疗前均有不同程度的增高；具体来说，新辅助化疗前大肠癌组织细胞凋亡指数最高为5.2%，最低为0.9%，平均为(3.28%±1.15%)，新辅助化疗后肿瘤细胞凋亡指数最高为9.3%，最低为1.4%，平均为(5.37%±2.07%)，增幅在0.3%～5.8%之间(P=0.000<0.05)。本组的研究结果与任峰[22]等相关研究结果相当或略高，说明新辅助化疗能显著诱导人体大肠癌肿瘤细胞的凋亡。因此我们认为：新辅助化疗在控制和延缓大肠癌进展方面发挥了重要作用。

综上所述，给予大肠癌患者新辅助化疗可以使肿瘤细胞的凋亡率增加，为今后的肿瘤学研究提供了可信的实验室数据。但大肠癌患者预后的影响因素较复杂，各种影响因素的确定还需要大样本多中心的临床对照研究。确定新辅助化疗患者的长期生存状况及该方法的优势，仍需长时间的临床观察及随访。

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