丹参多酚酸对大鼠脑缺血再灌注内质网应激的影响

王 伟

脑缺血导致神经细胞凋亡的机制未明。脑缺血引起中枢神经系统损伤导致严重的后遗症如麻痹、记忆障碍，甚至可能导致死亡。神经元细胞具有高度发育的内质网，内质网(endoplasmic reticulum，ER)是一种细胞器，能够合成加工糖类和加工折叠分泌性蛋白，同时还是细胞储存Ca2+的重要场所。有研究证实，内质网功能紊乱在缺血性脑损伤中起着重要作用，内质网功能紊乱将可引起细胞损伤并导致细胞凋亡[1]。丹参属于唇齿科植物，其根茎有活血、养血、通心络作用，已经广泛应用于心血管疾病、脑血管疾病、白血病等。注射用丹参多酚酸(Salvianolate)是应用现代工艺从丹参中提取的水溶性生物成分，主要成分是丹酚酸B，大量的研究表明能通过降低大鼠神经行为学评分，提高大鼠血清VEGF与IL-10含量，保护神经元，增加缺血半暗带区域内神经元数目[2]。但其与内质网关系研究报告相对较少，本研究通过制备大鼠缺血再灌注模型，探讨注射用丹参多酚酸的脑保护作用是否与内质网相关，探讨可能存在的相关机制。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组与模型制备：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重300±20g，由郑州大学实验动物中心提供。随机将54只SD大鼠分成：Sham组、IR组以及注射用丹参多酚酸治疗组(n=18)。模型制备方法:改良Zea Longa法制备大鼠右侧中动脉缺血再灌注模型。Sham组手术中分离右侧颈总、颈内、颈外动脉但不插入线栓。注射用丹参多酚酸治疗组、IR组线栓在缺血2小时后,抽出线栓再灌注24小时。动物苏醒后出现眼裂变小、瞳孔缩小和左侧躯体运动障碍及右侧Horner征即为造模成功。丹参多酚酸组在缺血2小时再灌注24小时后给予连续7天10mg/kg尾静脉注射,每日1次。Sham组、IR组给予尾静脉注射等量生理盐水[3]。神经功能评分后取脑。

1.1.2 试剂与仪器：注射用丹参多酚酸(国药准字Z20110011,天津天士力之骄药业有限公司)，手术器械(上海手术器械厂)；氯化三苯基四氮唑(TTC,批号:030227,北京华越洋生物科技有限公司)；低温高速离心机(美国,Thermo Fisher)；一抗兔抗大鼠(美国Santa Cruz公司)；二抗:羊抗兔(丹麦Dako公司)；倒置显微镜、石蜡切片机(德国Leica公司)；电泳仪(北京市六一仪器厂,DYY-6C)。

1.2 方法

1.2.1 脑梗死体积测定：每组取6只大鼠，深度麻醉后迅速取脑组织，将完整脑组织放入冰箱中-20℃快速冷冻20分钟,采用脑组织切片机以冠状位平行切5片，厚度约为2mm。2%TTC缓冲液充分浸泡大脑切片，避光后放置40℃恒温箱中20分钟后，4%多聚甲醛固定，将照片输入计算机软件中,用分析软件计算大脑的梗死体积百分比。梗死体积百分比=(左侧正常脑组织体积-右侧正常脑组织的体积)/左侧正常脑组织体积×100%,进行统计分析。

1.2.2 HE染色标本的制备：每组选取6只大鼠先用4%多聚甲醛灌流固定后，断头取脑，4%多聚甲醛固定标本24小时，采用梯度乙醇脱水和石蜡包埋。将蜡块放置在切片机上切片(厚5μm)，展片后放入4℃冰箱中保存备用。60℃烤箱中烘烤35分钟，脱蜡、二甲苯、梯度乙醇脱蜡至纯水，用苏木素染色10分钟，自来水冲洗；1%盐酸乙醇分化4～6秒、返蓝；伊红染色2分钟、冲洗，脱水、透明、封片后显微镜下观察。

1.2.3 Western blotting检测大脑组织中CASPASE-12的含量： 大鼠 (n=6) 深麻醉后处死, 留取右侧脑组织置于冰上，

Sham组取右侧脑组织100mg， 加入1ml RIPA裂解液进行匀浆，低温离心机12000rmp/分，离心15分钟，弃沉淀取上清，BCA法检测蛋白浓度，按1:1比例加入5×SDS buffer，95°煮沸5分钟变性后放入-80℃冰箱保存。总蛋白上样、电泳、转膜、封闭、一抗(β-actin)4℃过夜；洗膜后加二抗孵育1小时、洗膜、发光、显影、X射线定影。

2.结果

2.1 神经功能评分及脑梗死体积测定 Sham组两侧大脑组织为均匀玫瑰红色，未见有白色梗死灶；IR组和丹参多酚酸组则发现右侧大脑组织出现不同程度的苍白色梗死灶，但与IR组相比较，丹参多酚酸组脑梗死体积较小(P<0.05，见表1)。

表1 各组脑梗死体积测定(n=6)

注:与缺血再灌注组比较*P<0.05。

2.2 镜下观察大鼠脑组织神经细胞组织病理学的变化 镜下观察可见Sham组脑组织神经细胞排列整齐，边界清楚，形态正常，核大而圆，核膜和核仁清晰可见。IR组神经细胞呈缺血性改变，排列紊乱，胞体肿胀变形成多角形、核固缩；细胞坏死后的酶性分解过程继续发展导致核溶解、消失。残留细胞轮廓称鬼影细胞(Ghost cell)。丹参多酚酸组神经细胞缺血性改变较IR组减轻，细胞间质水肿明显减轻，神经细胞及细胞间质水肿明显减轻(见图1)。

图1 各组大鼠脑组织神经元形态学变化(HE染色×200)

A：Sham组 B：IR组 C：丹参多酚酸处理组图2 各组大鼠脑组织中Caspase-12的蛋白含量

2.3 Western Blotting检测各组Caspase-12的蛋白含量 与Sham组相比IR组大鼠脑组织中Caspase-12蛋白表达显著升高(P<0.05)。丹参多酚酸组较IR组表达降低(P<0.05，见图2)。

3.讨论

脑缺血时，特别是缺血再灌注过程中触发多种不同的但又重叠的细胞信号传导通路，引起细胞凋亡或坏死，这一过程与再灌注过程中产生过量的自由基和细胞内钙稳态失衡有关；有研究表明，内质网参与这一过程[4]。内质网 (ER) 细胞内的细胞器，其在维护细胞内钙稳态和合成正确的折叠的新分泌核膜蛋白中发挥重要作用[5]。正常情况下，内质网产生错误折叠蛋白量少而且内质网存在自我修复机制；然而当内质网处于葡萄糖剥夺、自由基损伤、内质网内钙耗竭的这种不利条件下，引起内质网钙离子溶度下降，依赖钙离子的蛋白酶失活，破坏内质网正常功能，引起大量未经折叠蛋白及错误折叠蛋白产生，聚集在内质网，引起未折叠蛋白堆积，称之为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)[6]。内质网为应对这一反应，一个主要途径是通过启动PKR样内质网eIF2激酶(PKR-like endoplasmic reticulum eIF2 kinase，PERK)抑制真核启动因子eif2和eif4(eukaryotic initiation factor，eif)功能抑制蛋白质翻译生成，减少未折叠蛋白产生；另一个途径是上调内质网伴侣蛋白Bip/GRP78和GRP94的表达，修复未折叠的蛋白质；最后当内质网功能难以修复，内质网将激活Caspase-12蛋白酶系统启动细胞死亡程序，以上内质网反应称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[6]。短期内内质网应激起保护作用，但内质网应激长期存在，将引起细胞凋亡[6]。Caspase-12属于胱天蛋白酶家族一员，正常情况下，Caspase-12以前体形式存在，不具备活性；当内质网钙离子耗竭、大量未折叠蛋白聚集得不到修复时Caspase-12激活[7]。Caspase-12激活后灭活抗凋亡蛋白GRP78、分解细胞结构，诱发和执行ER应激相关的细胞死亡程序，促进细胞凋亡[8]。朱海英等利用线栓法脑缺血再灌注损伤模型研究发现，缺血2小时，再灌注12小时，Caspase-12逐渐表达，再灌注24小时后表达达到高峰，72小时后逐渐回落[9]，而且敲除Caspase-12的小鼠相对于野生型小鼠，对于内质网诱导的细胞凋亡具有抵抗性，但仍对其他途径诱导的细胞凋亡敏感[10]。本研究发现，假手术组Caspase-12蛋白仅仅少量表达，而缺血再灌注组Caspase-12蛋白不仅大量表达，伴随脑梗死面积大，细胞形态破坏，缺血细胞细胞核溶解、消失。

注射用丹参多酚酸是采用现代工艺提取丹参的水溶成分，经柱层析技术分离提纯的多种酚酸类化合物加工而成的冻干粉针。其主要成分是丹酚酸B，具有降低纤维蛋白原、血浆C反应蛋白水平代谢等多种药理作用，广泛应用在治疗缺血性心脑血管疾病中，是有脑神经保护作用的新一代中药注射剂。近年来，丹酚酸B在治疗脑缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制逐渐成为热点而被广泛研究，丹酚酸B加快改善保护线粒体，减少线粒体丙二醛含量，提高线粒体ATP酶活性，减少脑梗死面积[3]。我们研究发现，与IR组相比，丹参多酚酸组脑梗死面积减少，神经细胞缺血性改变均较IR组减轻，细胞间质水肿明显减轻，Caspase-12蛋白表达减少。

综上所述，注射用丹参多酚酸可能通过下调缺血再灌注大鼠脑组织中的Caspase-12蛋白表达，减轻内质网的应激反应从而发挥抗细胞凋亡的作用。

1 刘楠，李岩，牛振华，等.内质网应激介导的神经细胞凋亡通路[J].中风与神经疾病杂志，2013，30(8)：757-759.

2 王淑.注射用丹参多酚酸对脑缺血大鼠VEGF、IL-10表达的影响[D].郑州大学，2016.

3 李富强，王伟，冯涛，等.注射用丹参多酚酸对大鼠脑缺血再灌注线粒体ATP酶活性的影响[J].中国实用神经疾病杂志，2017，20(9)：23-26.

4 TABAS I，RON D.Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress[J].Nat Cell Biol，2011，13(3)： 184-190.

5 韩江全，胡泳涛，林冬融，等.内质网应激结合线粒体在高血糖加重脑缺血再灌注损伤中的作用[J].中风与神经疾病杂志，2012，29(7)：593-597.

6 CAO SS，KAUFMAN RJ.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress in cell fate decision and human disease[J].Antioxid Redox Signal，2014，21(3)： 396-413.

7 GARDNER BM，PINCUS D，GOTTHARDT K，et al.Endoplasmic reticulum stress sensing in the unfolded protein response[J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2013，5(3)： a013169.

8 DE LA CADENA SG，HERNáNDEZ-FONSECA K，CAMACHO-ARROYO I，et al.Glucose deprivation induces reticulum stress by the PERK pathway and caspase-7-and calpain-mediated caspase-12 activation[J].Apoptosis，2014，19(3)： 414-427.

9 朱海英，孙红玉，冯光坤，等.姜黄素抑制大鼠脑缺血再灌注损伤内质网应激的研究[J].中华老年心脑血管病杂志，2015，17(4)：416-420.

10 NAKAGAWA T，ZHU H，MORISHIMA N，et al.Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta[J].Nature，2000，403(6765)： 98-103.