微小隐孢子虫分子流行病学

陈 苗，李 慧，唐 莉，阚珍珍，李文超，顾有方

（安徽科技学院动物科学学院，安徽 凤阳 233100）

隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是世界范围内的人畜共患的寄生虫疾病。其病原体是隐孢子虫。宿主十分广泛，寄生于人类，哺乳类，禽类，鱼类等240多种脊椎动物体内。传播途径多通过粪-口途径传播，或通过食入含有卵囊的食物、水、接触受污染的物品而感染，可以在人与人、人与动物、动物与动物之间传播。在动物体上表现为腹泻和呼吸道症状，在人体主要表现为腹泻、恶心、呕吐等症状，在营养不良或免疫功能受损、不全的人中最为明显，甚至可以威胁生命，特别是在发展中国家。在患艾滋病的个体中，可以导致致死性腹泻。因此，隐孢子虫（Cryptosporidium）在公共卫生上具有十分重要的意义。

1907年，Tyzzer首次在各种常见的小鼠的胃腺上皮细胞中发现并命名为鼠隐孢子虫（C.muris），此后，在1912年又在小鼠的肠道中发现了另外一个新物种并将其命名为微小隐孢子虫（C.parvum）。隐孢子虫是感染野生和家养动物最广泛传播的原生动物寄生虫之一，被认为是继轮状病毒之后导致儿童腹泻的第二大主要原因。截止到目前为止，分子流行病学研究已经鉴定30个有效种，40多种基因型，其中有21个隐孢子虫虫种在人体中发现。大多数的隐孢子虫的物种和基因型具有宿主特异性，对宿主的致病性也有较大的差异。大约20多种不同的物种会导致人类严重的中度感染，人隐孢子虫（C.hominis）和微小隐孢子虫（C.parvum）是最主要的病原体。人隐孢子虫几乎只感染人，而微小隐孢子虫既可以感染人，也可以感染动物，是最主要的人畜共患隐孢子虫虫种。其他的隐孢子虫的虫种感染的病例较少且呈现地区优势，多呈散发。隐孢子病对人类和动物产生极大的威胁，产生了一定程度的经济损失。近年来，其受到国内外众多学者的重视，成为寄生虫学研究的热门课题。

随着分子生物技术的发展，用于隐孢子虫基因型，基因亚型的分型工具也得到了快速的发展。聚合酶链式反应（PCR）就被广泛的用于各领域隐孢子虫检测。目前，小亚基核糖体 rRNA（SSU rRNA）和 gp60（gp40/15）被用于区分物种基因型、基因亚型的最佳分子标记，尽管，最近十年，诊断工具检测基因型和亚型水平上鉴别隐孢子虫的种类有所改善，但是我们对每个物种在动物和人类的传播潜力尚不明确。下面对感染人体最主要的微小隐孢子虫虫种的分子流行病学进行综述。

1 微小隐孢子虫基因型及其亚型

最主要的感染人的两个隐孢子虫物种是人隐孢子虫和微小隐孢子虫。牛被公认为人类隐孢子虫病最主要的传染源。除此之外还有火鸡隐孢子虫（C.meleagridis）、猫隐孢子虫（C.felis）、犬隐孢子虫（C.canis）等引起的人体感染的病例也在中国出现，个别虫种呈现地区性的优势，这些虫种是在没有出现隐孢子虫的情况下在郊区的儿童中发现的。在工业国家，例如，欧洲、澳大利亚、美国，人隐孢子虫感染和微小隐孢子虫感染是一样广泛的；然而，在中西方国家，从人群患寄生虫疾病的病人中分离微小隐孢子虫是占主导的物种，主要感染2岁以下的儿童，和15～45岁的女性。

随着分子生物学的不断发展，gp60被广泛应用于区分隐孢子虫的基因亚型。gp60是目前鉴定的最为单一的多态性分子标记，将隐孢子虫的生物学特征，临床表现和不同的亚型家族相联系成为可能。在北美、欧洲和澳大利亚，一些常见的微小隐孢子虫牛源IIa亚型和一些IId亚型在人群的病例中被发现。IIa是这些地区的微小隐孢子虫的优势亚型且为犊牛广为流行的亚型家族。在葡萄牙、荷兰、北爱尔兰和斯洛文尼亚，2种主要的IIa亚型IIaA15G2R1和IIaA18G3R1从人群患寄生虫病例中分离出来，并且在牛群中也是常见的亚型。在葡萄牙，4种IId亚型发现于HIV+的人群当中，先前有2个亚型在同一地区的羔羊和犊牛体内也发现了，在荷兰，一些人群也感染了3个IId亚型，但同一个研究中，在犊牛体内没有发现任何一个IId亚型，在爱尔兰和澳大利亚，2个人体病例中各发现了1个IId亚型，在美国和加拿大，人体和犊牛体内都未检测到IId亚型。在美国、加拿大、葡萄牙、斯洛文尼亚、英国、爱尔兰、北爱尔兰和澳大利亚，微小隐孢子虫亚型家族IIc只在人类病例中发现，在动物体内没有发现。IIc具有人-人传播的特性且归因于多数人体感染微小隐孢子虫。在欧洲国家的市区，例如葡萄牙里斯本，IIa和IIc亚型在人体中都较为常见。在科威特，儿童仅感染IIa和IId亚型，需要我们注意的事情是，患微小隐孢子虫亚型家族IIa和86%亚型家族IId的儿童都与动物有亲密的接触，微小隐孢子虫在动物和人群中大范围的流行和传播且其基因型相同，这就意味着是由于人和动物亲密接触而引起的传播，其中IIdA20G1被认为是最常见的亚型。与发达国家不同的是，在发展中国家，例如，印度、马拉维、乌干达和肯尼亚，微小隐孢子虫亚型家族IIb和IIe可以感染人类而在这些地区的同域动物体内没有检测到。在欧洲国家，II1型也偶尔会在斯洛文尼亚人群当中发现存在。

2 诊断与检测

2.1 饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色

传统检测微小隐孢子虫的方法中常用的是饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色（MAF），MAF通过显微镜观察能提高其敏感性为54.8%。其优点是成本低，操作方便简单，敏感性较低，然而，容易出现假阴性的现象，造成实验的不准确性。

2.2 Ziehl-Neelsen技术

改进的Ziehl-Neelsen技术能够检测大多数有很高流行率的隐孢子虫属。然而显微镜的测定方法有一些限制因素，特别是在非流行地区有少量卵囊感染窝藏的诊断中，还有一些大小在4～6um的卵囊很容易和粪便样本中的其他样本混淆。

2.3 免疫学检测

免疫学方法主要有酶联免疫吸附法（ELASE），直接荧光抗体检测（DFA）等，这两种方法被广泛的使用于抗体特异性检测，DFA检测的敏感性特异性达到96%～100%和99%～100%，ELASE检测的敏感性特异性达到94%～97%和99%～100%。

2.4 PCR技术

1991年，Laxer第一次将PCR技术用于检测隐孢子虫，此后PCR技术就被广泛的应用于各种隐孢子虫虫种鉴定和基因分型。目前分子生物学检测有普通PCR，巢式PCR（Nested PCR），聚合酶链式反应-限制性片段多态性分析（PCR-RFLP）等。PCR技术是目前隐孢子虫检测最敏感最快速的方法之一。其敏感性可达到97%-100%，特异性能达到100%。最佳的基因标记位点有小亚基核糖体rRNA（SSU rRNA）,卵囊壁蛋白（COWP）,热休克蛋白（HSP70）等。在每个物种内他们是保守的，然而，在不同的物种间他们又是具有多态性的。这些标记通常被放大，通过使用特定的引物从临床样本中的直接提取DNA片段，然后进行Sanger测序或RELP。SSU rRNA具有多拷贝性，高变保守的特点，使其被广泛的使用（86%的出版物中）去分离环境、野生或家养的动物和人类样本,几乎可以鉴别出隐孢子虫所有的物种。而基于COWP基因的工具116个原始出版物中仅用于23个（许多结合基于SSU rRNA的工具）,其他基因几乎没有使用过。

2.5 全基因组测序和多位点序列分型

目前，已经制定了程序来促进全基因组测序（WGS）和高级分型人类致病性隐孢子虫属。全基因组测序（WGS）和多位点序列分型（MLST）工具被中国的科学家使用在剧毒或超传染性的微小隐孢子虫和人隐孢子虫的亚型中。但是动物模型和体外培养体系不能够获得足够数量的经过纯化过后的卵囊，所以，全基因组测序遇到了阻碍，截止到目前只有3个隐孢子虫种4个虫株被测序。总之，基因型和亚型分型工具广泛的使用于各种动物的隐孢子虫属的鉴定。

3 预防与治疗

虽然隐孢子虫病的给人类和动物带来巨大危害，对人类和动物造成生命威胁，产生了一定的经济损失，具有十分重要的公共卫生学意义。但是，现在用于治疗隐孢子虫病的药物和疫苗却是少之又少，只有少数药物用于治疗，国外的学者已经筛选出了40多种药物来治疗隐孢子虫，但大多数都是没有疗效的。阻碍新型抗寄生虫药物发展的原因是隐孢子虫和其他的顶复门原虫相比较在很大程度上是由于他的独特代谢的结果，缺乏顶质体和基因改造工具，最重要的是缺乏动物模型来验证药物的疗效。当前被食品药物管理局批准的药物硝唑尼特被广泛的使用在儿童和在有免疫活性的病人。而在免疫缺陷的病人中被认为是无效的。还有一些没有被食品药物管理局批准的药物如巴龙霉素，其疗效不如硝唑尼特。车等,发现补骨脂及双氢青篙素联合应用杀灭隐孢子虫效果较好。随着基因的发展转变和其他的反向基因技术加上新颖的动物模型已经打开了寻找隐孢子虫病的药物发现筛选过程的大门。

“预防大于治疗”，这是所有疾病所遵从的原则，寄生虫疾病也不例外。由于隐孢子虫病的传播途径多通过粪-口途径传播，主要是食入含有卵囊的食物、水、接触受污染的物品而感染。所以在预防上面应该注意粪便的管理和个人的卫生，防止病人、病畜和带虫者的粪便污染了食物和水以及其他的物品，避免食入和接触这些受污染的物品，如接触到要洗手消毒，保护好免疫力低下的人群，增强免疫力。

4 未来展望

在2004～2011年，在世界范围内报道的，隐孢子虫是超过60%水传播的原生动物寄生虫疾病爆发的原因，此后，受到医学界的重点关注,国内外的学者也做了大量的研究。但目前对于隐孢子虫感染的人群或动物没有特别疗效的药物治疗。随着分子生物技术的发展，开发简易快速的隐孢子虫病诊断试剂盒，通过基因型和基因亚型的分型工具从而更准确的提高隐孢子虫病检测的效果。同时，着重研究有效的治疗药物和新一代抗隐孢子虫病疫苗等方面。