延边部分地区猪致病性大肠杆菌的分离与鉴定

金京顺，焦淑婷，张枫燃，李海峰★

（1.吉林省延吉市动物疫病预防控制中心，吉林 延吉 133002；2.延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉 133002）

大肠杆菌是引起猪腹泻的主要致病菌之一，可引起不同年龄段的猪发生仔猪黄痢、仔猪白痢及猪大肠杆菌病，猪大肠杆菌病是影响养猪企业的重要肠道传染病之一，常常造成养猪企业的重大损失，对养猪生产危害很大。近年来，延边地区养猪业发展势头良好，猪大肠杆菌病虽然得到一定控制，但在一些环境、饲养管理、卫生条件较差的猪场仍时有发生，发病率可达30%～50%，严重制约该地区养猪业的健康发展。本文对2017年1月至2018年5月延边地区的延吉市、龙井市、图们市的养猪场病死猪及疑似大肠杆菌感染的腹泻病猪病料进行了病原的分离及鉴定，为该病的诊断及防制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

2017年1月～2018年5月，共采集了48份病料样本，其中延吉市15份；龙井市22份；图们市11份。

1.1.2 实验动物

健康昆明种小白鼠由延边大学实验动物中心提供。

1.1.3 仪器设备

电热恒温培养箱（常州菲普实验仪器厂）、超净工作台（大连金石实验室设备有限公司）、全自动高压灭菌锅（日本ALP）、生物显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离、纯化

将采集的样本送往实验室接种于普通肉汤中，37℃培养12～24h。从普通肉汤中取100μL菌液分别接种于麦康凯琼脂培养基、伊红美兰培养基，涂板培养，37℃，24h。挑取单个可疑菌落接种于营养琼脂培养基进行纯培养。将纯化的细菌保存，革兰氏染色，镜检。

1.2.2 分离菌的生化鉴定

在超净工作台上，分别挑取各纯培养物的单个菌落，进行乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇生化、三糖铁琼脂试验、硝酸盐还原实验、MR试验、VP试验等14项生化鉴定试验。

1.2.3 致病性试验

将分离菌株接种于营养肉汤，37℃，18h，将菌液稀释成1010CFU/mL，试验小白鼠分为试验组和对照组，每个组5只小白鼠，试验组小白鼠腹腔接种稀释后的菌液，0.3mL/只；对照组小白鼠同时腹腔接种灭菌生理盐水，0.3mL/只。各组小白鼠单笼隔离饲养，分别于24h、48h观察小白鼠的状态、是否发病，并做好记录。

1.2.4 大肠杆菌血清型鉴定

参考方爽的方法进行分离株大肠杆菌O抗原血清型分型。

2 结果

2.1 分离培养结果

纯培养后的待检菌株在麦康凯培养基上出现圆形、表面光滑、湿润、稍凸起的菌落。菌落呈玫瑰红色。而在伊红美兰培养基上生长的菌落，呈现黑色，略带金属闪光，符合大肠杆菌菌落特征。革兰氏染色后，显微镜下可见紫红色、着色均匀、单个或成对的无荚膜、无芽孢、两端钝圆的短杆菌。分离得到40株疑似菌株符合猪大肠杆菌形态特征。

2.2 生化鉴定结果

对分离得到的40株大肠杆菌菌株进行生化试验，结果表明，分离菌株均能使葡萄糖、乳糖和蔗糖发酵；甘露醇、麦芽糖试验结果为产酸产气；三糖铁试验底层产酸变黄；明胶液化试验阴性、氧化酶试验阴性、尿素酶试验阴性；过氧化氢酶试验阳性；MR试验阳性；VP试验阴性。以上生化试验结果符合大肠杆菌的特征，表明分离到的菌株为大肠杆菌。

2.3 致病性试验结果

36株大肠杆菌培养物接种后，试验组小白鼠48h内全部死亡；另外4株大肠杆菌培养物接种后，48h内有1～2只小白鼠死亡，未死亡小白鼠精神状态不佳，饮食饮水减少，出现腹泻症状。而对照组的小白鼠未发生死亡，全部存活。对死亡的小白鼠进行解剖，观察病理变化，可见死亡小白鼠的肝脏肿大、质地脆硬、心包膜增厚。取死亡小白鼠的肝脏，涂片染色，显微镜检查，镜下可见到典型的大肠杆菌。依此判断本次分离到的40株大肠杆菌均有致病性，其中36株为高致病性菌株，4株为低致病性菌株。

2.4 血清型鉴定

对分离得到的40株大肠杆菌菌株分别进行O抗原血清型鉴定，其中2株定型未成功，1株定型试验发生自凝，其余37株分型成功，共鉴定出29个不同的血清型。其中O6（4/37），O 78（5/37）、O 90（7/37）、O 107（7/37）为优势血清型，占全部分离菌株的62.1%。

3 讨论

大肠杆菌是各种动物肠道内的常在菌，大肠杆菌血清型众多，其抗原类型主要有K、O、H组成。据文献报道，大肠杆菌在不同地区的血清型分布有很大的差异。本试验结果显示，延边地区部分猪场此次分离到的大肠杆菌的优势血清型为O6、O78、O90、O107，本次分离菌株鉴定的血清型与国内相关文献报道的不同地区分离的猪源性大肠杆菌的血清型有一定的差异性。

大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据O抗原对大肠杆菌进行血清型分型，至今已发现170多种血清型。由于大肠杆菌血清型众多，不同地区不同养殖场流行的菌株可能存在很大的差异，给大肠杆菌病的防制带来了很大的困难。并且随着时间和地域的变化，大肠杆菌可能会发生变异，出现新的血清型。本次调查中出现的未定型菌株，可能是大肠杆菌发生新的变化而出现的新血清型，对这些未定血清型菌株的毒力特征、致病性等应引起重视，并开展相应的研究工作。