浙江地区晚期非小细胞肺癌患者循环肿瘤DNA突变特征的检测

林晓 董文韬 赖霄晶 封巍 郁肖夫 谷庆 肖雯 郑晓

[摘要] 目的 初步探究浙江地区晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的突变特征并为患者提供临床靶向用药理论依据。 方法 采用高通量测序技术，对79例浙江籍贯的NSCLC患者的ctDNA样本进行基因靶向捕获深度测序，对测序结果进行回顾性统计分析。 结果 EGFR基因的突变频率最高，达到56.5%，发现的高频突变还包括存在于TP53（33.3%）、KRAS（30.4%）、ERBB2（23.2%）、FGFR1（18.8%）、PTEN（15.9%）等基因的致病位点。EGFR突变更容易出现在女性、不吸烟、肺腺癌患者（P<0.05），KRAS突变更容易出现在年轻、吸烟患者（P<0.05），ERBB2突变容易出现在不吸烟的患者（P<0.05）。在44例（44/79，55.7%）中共发现了存在于8个基因的29个靶向用药位点突变，在22例（22/44，50.0%）中检测到同时存在多个用药位点的现象，9例以往接受过酪氨酸激酶抑制剂药物治疗的复发患者均检测到T790M突变。结论 NSCLC具有十分复杂的突变特征，基于ctDNA的高通量测序在一定程度上可以较全面反映肿瘤的分子特征，为患者提供更多的靶向用药指导。

[关键词] 非小细胞肺癌;循环肿瘤DNA;高通量测序;基因突变

[中图分类号] R734.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2018）35-0026-06

[Abstract] Objective To investigate the mutation characteristics of circulating tumor DNA（ctDNA） in patients with advanced non-small cell lung cancer（NSCLC） in Zhejiang， and to provide theoretical basis for clinical targeted drug use. Methods High-throughput sequencing technology was used for targeted capture and deep sequencing of the ctDNA samples of 79 patients with NSCLC in Zhejiang， and the sequencing results were retrospectively analyzed. Results The mutation frequency of EGFR gene was the highest， reaching 56.5%. The high frequency mutations included sites on TP53 （33.3%）， KRAS （30.4%）， ERBB2 （23.2%）， FGFR1 （18.8%）， PTEN （15.9%）， etc. The EGFR mutations were more likely to occur in women， non-smokers， and patients with lung adenocarcinoma（P<0.05）. The KRAS mutations were more likely to occur in young patients and smokers（P<0.05）. The ERBB2 mutations were more likely to occur in non-smokers （P<0.05）. In 44 cases （44/79， 55.7%）， 29 targeted drug site mutations were found in 8 genes， and multiple drug sites were detected in 22 cases（22/44， 50.0%）. The T790M mutation was detected in 9 relapsed patients who had previously received tyrosine kinase inhibitor therapy. Conclusion NSCLC has very complex mutation characteristics. High-throughput sequencing based on ctDNA can reflect the molecular characteristics of tumors to a certain extent， and provide more targeted drug guidance for patients.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Circulating tumor DNA; High-throughput sequencing; Gene mutation

肺癌已成為我国发病率与死亡率均为第一高的恶性肿瘤，根据病理类型肺癌分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer， SCLC），其中NSCLC占80%～85%[1]。近年来随着癌症基因组学与转化医学的快速发展，从分子层面上对NSCLC进行早筛、监测、治疗、预后的研究取得了许多重大突破，在最新的美国国立综合癌症网络指南与中国肺癌诊疗专家共识中，都建议将以肺癌驱动基因检测为基础的分子病理分型，作为肺癌治疗及用药的临床依据[2]。目前组织样本的检测结果仍为基因特征判定的金标准，但组织样本的获取难度高、患者痛苦大、无法连续取样、无法克服肿瘤异质性等问题一直困扰着研究人员与临床医生[3]。

基于现有的研究成果，以循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）检测为代表的液态活检是未来有望代替甚至超越组织样本分子检测的技术手段[4]。ctDNA是来源于肿瘤细胞的DNA片段，其主要存在于癌症患者的外周血中，具有易获取、可连续取样等特点。CtDNA可能来源于任一肿瘤细胞，所以在反映肿瘤细胞突变特征的同时，可以一定程度上克服肿瘤的异质性，且血液中ctDNA的半衰期在16 min～2.5 h，可以更“及时”地反映肿瘤状态[5-7]。

血浆游离DNA（cell free DNA，cfDNA）在血液中的含量为（1.0～10）ng/mL，通常情况下ctDNA仅占cfDNA的0.1%～1%，且在肿瘤早期阶段ctDNA的含量会更低[8]，在现有的高灵敏度分子检测方法中，ARMS法[9]、ddPCR法[10]等只能检测已知的单分子突变类型，而高通量测序法则可以在检测多分子突变的同时，发现新的突变类型，非常适用于精准医学的研究，但成本较前两者稍高[11]。

目前对于NSCLC的分子研究大多聚焦于某个或某几个驱动基因，这在一定程度上可能会限制新成果的发现，此次研究采用高通量测序技术对79例浙江地区NSCLC患者进行基因靶捕获深度测序，在探究浙江地区NSCLC分子突变特征、总结基因突变与临床病理关系的同时，为筛选分子靶向治疗目标人群提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年6月～2018年5月浙江省肿瘤医院79例NSCLC患者的血液样本，所有入组患者籍贯均隶属浙江省。男44例，女35例，中位年龄62岁，所有患者经组织病理学确诊为NSCLC，其中肺腺癌64例，肺鳞癌15例，UICC第8版TNM分期显示ⅢB期10例，Ⅳ期69例，有吸烟史23例，初治21例，有直系亲属癌症家族史9例。所有患者均签署书面知情同意书，本研究已通过浙江省肿瘤医院医学伦理委员会审查批准。

1.2 方法

1.2.1 血液样本采集与DNA提取  使用Streck采血管采集每位入组患者10 mL外周血，轻柔颠倒10次后于6℃～35℃保存，2 d内进行DNA提取实验。DNA提取试剂盒DNeasy Blood kit（德国Qiagen公司）用于提取血液样本DNA，实验过程严格按照试剂盒说明书进行。利用Nanodrop检测DNA的纯度、电泳分析DNA的降解程度、Qubit精确定量DNA的浓度，所有检测均合格的DNA样品用于后续建库实验，不合格样本需重新抽提DNA或重新采样。

1.2.2 文库构建及靶向捕获测序  建库过程采用KAPA Hyper prep kit二代测序文库构建试剂盒（美国Illumina公司），将片段化的DNA双端末端修复，并添加dAMP到DNA片段的3端，之后片段两端分别连接上包含barcode信息的接头，完成文库制备，经PCR反应扩增文库。采用靶向捕获panel（包含78个检测基因）进行目标 DNA文库的高效富集（有10例患者只进行7个驱动基因的检测），检测文库的质量达到标准后，利用Illumina NextSeq CN500平台进行PE150测序（高通量双端测序），平均测序深度17640×。

1.2.3 生物信息学分析  使用质控软件FastQC对下机数据进行质检，质量不合格的样本需重新进行实验，使用序列比对软件BWA将测序结果比对到人类参考基因组（hg19），使用GATK进行序列比对优化，Samtools软件进行相关格式转化，使用Varscan2和Speedseq进行基因SNV和InDel变异检测，用ANNOVAR软件对其进行变异注释。结果经Cosmic、dbSNP数据库过滤后，去掉同义突变，选取突变丰度大于0.1%的变异为最终检测结果。

1.3 统计学分析

所有数据均使用SPSS20.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，突变基因与临床资料关联分析采用χ2检验或Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者ctDNA突变特征分析

遵从患者意愿，在79例入组患者中，10例患者接受了7基因panel的检测，69例患者接受了78基因panel的检测（表1）。在69例患者78基因的检测结果中，对突变频率前30位的基因进行突变频谱分析。结果显示，基因EGFR突变频率最高，达到56.5%（39/69），TP53、KRAS这两种NSCLC常见突变的突变频率分别为33.3%（23/69）、30.4%（21/69），此外，还发现存在于ERBB2（23.2%，16/69）、FGFR1（18.8%，13/69）、PTEN（15.9%，11/69）、BRAF（14.5%，10/69）等基因的致病突變。

EGFR基因的突变多发生于18～21号外显子之间（94.9%，37/39），其中L858R占28.2%（11/39），19号外显子缺失占20.5%（8/39），T790M耐药突变占20.5%（8/39）。在14例患者中（35.9%，14/39）发现EGFR双突变现象，3例患者（7.7%，3/39）发现三突变，1例患者发现EGFR（AS1）-ARHGAP10融合突变。KRAS基因的突变位点多集中于2号外显子（95.2%，20/21），其中发生在12、13号密码子的突变占90.0%（18/20）。在BRAF基因发生突变的患者中，发现2例（20.0%，2/10）V600E突变，其他变异均为V600附近点突变，如p.L597P、p.K601I、p.G606E等。此外，在7位（10.1%，7/69）患者中发现了基因融合现象，发生的基因有ALK、RET、KDR、ABL1等，但并没有发现EML4-ALK融合突变。

2.2驱动基因突变与临床特征的关系

汇总了79例患者的7个驱动基因（ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、MET、NRAS）突变信息，并将突变情况与临床资料（性别、年龄、疾病分期、分型、吸烟史、治疗史、直系亲属患癌史）进行关联分析，结果表明EGFR、KRAS、ERBB2三个基因与某些临床特征具有显著相关性（表2）。EGFR基因突变的患者中，女性阳性突变率为80.0%（28/35），高于男性40.9%（18/44），腺癌64.1%（41/64）高于鳞癌33.3%（5/15），无吸烟史83.3%（30/36）高于有吸烟史37.2%（16/43），差异均有统计学意义（P<0.05）;KRAS基因突变的患者中，年龄<60岁和≥60岁的阳性突变频率分别为46.7%（14/30）及22.4%（11/49），有吸烟史和无吸烟史的突变频率分别为41.9%（18/43）及19.4%（7/36），差异均有统计学意义（P<0.05）;在ERBB2基因突变的患者中，无吸烟史患者则比有吸烟史患者有着更高的基因突变频率，分别为33.3%（12/36）及14.0%（6/43），差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 靶向治疗用药位点

研究中进一步对79例晚期NSCLC患者基因检测结果中的靶向用药位点进行统计，位点均为FDA批准用于癌症靶向治疗的靶点。结果表明，在44例（55.7%，44/79）中共发现了存在于8个基因的29个靶向用药位点突变，其中频率最高的存在于27例（34.2%，27/79）中的EGFR用药突变（包括18外显子G719S、19外显子缺失、20外显子T790M、21外显子L858R），在14例患者（17.7%，14/79）中发现ERBB2用药突变，其他基因还包括BRAF（V600E）、CDKN2A、KIT、MAP2K1、PDGFRA、PIK3CA。在22例（50.0%，22/44）中检测到同时存在多个用药位点的现象，对于患者来说更多用药位点的发现代表着更多治疗策略的选择，这对控制疾病进展及应对耐药发生具有实际意义。检测到9例患者存在经典的靶向药物耐药突变EGFR（T790M），对比治疗记录后发现，这9例患者以往均接受过酪氨酸激酶抑制剂类药物治疗且目前疾病复发，提示在临床可以根据患者基因特征对预后进行一定的评估。

3 讨论

越来越多的研究显示，对于NSCLC患者尤其是晚期患者，精准靶向用药相较于放化疗可以更大程度延长患者生命，利用基因检测技术探究患者靶向用药的突变基因，现已成为NSCLC临床治疗的常用手段[12-14]。目前普遍将组织学样本作为检测的金标准，但组织样本除取样过程复杂、创伤较大、无法连续取样等缺点外，对于某些体质较差或肿瘤生长位置危險的患者来说，难以通过手术或穿刺取得组织样本[15]，这些因素制约了基因检测在NSCLC中的应用。本研究中以患者ctDNA为样本，利用高通量测序技术探究浙江地区晚期NSCLC突变特征，同时为患者靶向用药做出指导。

以往关于NSCLC的研究结果显示，EGFR突变频率为40%左右[16]，KRAS突变频率约为20%[17]，FGFR1、ERBB2、BRAF突变频率为5%左右[18-20]，且NSCLC的基因突变往往具有一定人群特征性，如EGFR在非亚裔人群中的突变频率为10%～20%，KRAS在黄种人中的突变频率为5%～10%，在白种人中为20%[21，22]，MET在欧美人群中突变频率为3%～4%[23]等。此次研究中所检测到的基因突变频率略高于以往研究，推测可能的原因有：首先，研究中的入组人群均为晚期NSCLC患者，突变种类及数目较中早期多;其次，研究中采用高质量的ctDNA样本，一定程度上可以克服肿瘤的异质性;第三，大部分患者均发生了不同程度的转移，所以ctDNA不仅来源于原发灶，也会来自转移灶;第四，实验中所用捕获探针覆盖区域较广，可以发现基因更多位点的突变;第五，实验中采用了深度测序（平均测序深度17640×），且突变丰度截断值设置较低（实验中为0.1%，类似实验中为0.2%～0.5%），可以发现更多的低频突变;最后，研究中患者均为浙江地区人群，可能有一定的人群特征性。

在7个驱动基因与临床资料的关联分析中，EGFR基因突变常发生于女性、不吸烟、肺腺癌患者（P<0.05），这与以往的亚洲人群肺癌研究相符[24]，而吸烟对KRAS基因与ERBB2基因突变的影响在以往研究中有不同的结论。此次研究中发现，在18例ERBB2突变的患者中，17例患者均为肺腺癌，腺癌与鳞癌ERBB2阳性突变率分别为26.6%（17/64）与6.7%（1/15），提示ERBB2的突变可能与肺腺癌的发生相关，但由于样本量的限制，差异无统计学意义（P=0.19）。类似的情况也发生在ERBB2与家族史的关联分析中，接近一半有直系亲属患癌史的患者存在ERBB2突变，阳性突变率为44.4%（4/9），而在无家族史的患者中阳性突变率仅为20.0%（14/70），提示ERBB2基因的突变可能存在一定的遗传性，但是需要开展更大规模的研究（P=0.22）。

随着ctDNA相关检测技术的不断发展，ctDNA在NSCLC精准用药指导中体现出了越来越高的应用价值，在许多临床研究中ctDNA检测发现了组织检测未发现的用药位点突变，从而改善了患者的治疗结局，并且与NSCLC患者常规进行的驱动基因检测相比，基于高通量测序的大panel检测可以发现更多靶向用药位点。此次研究中除发现了NSCLC多个驱动基因的突变外，还发现了FGFR1、PTEN、PDGFRA、PIK3CA、MAP2K1、CDKN2A等许多NSCLC相关突变及用药位点，这使得我们可以更全面、更精准地掌握疾病分子特征，一方面为晚期NSCLC患者提供更多的药物选择及耐药应对策略，同时也提供了从分子层面进行NSCLC早筛、监测、耐药等研究的理论基础。

综上所述，晚期NSCLC患者中基因突变的数目及频率相对较高，采用高通量测序进行较大panel的检测可以更全面了解肿瘤分子特征，这对个体患者疾病的认识及靶向用药的选择都具有重要的实际意义。此外，选取特定地区范围人群可能会在一定程度上克服肿瘤异质性，可对该地区患者的疾病进行更加精准的检测与分析，给予针对性的特异治疗，使疗效最大化。

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（收稿日期：2018-09-10）