昼夜变温下高温对Bt棉铃壳杀虫蛋白及氮代谢生理的影响

李远，王桂霞,胡大鹏，Abidallah Eltayib，张丽雅，张祥，陈源，陈德华

（扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室，江苏扬州225009）

转Bt基因棉花是利用现代生物技术将苏云金杆菌的Bt基因导入棉花植株体内培育的转基因产品[1]，是当今世界种植面积最大、分布范围最广的转基因农作物之一[2-5]。转Bt基因抗虫棉表达的Bt蛋白，对棉铃虫等鳞翅目害虫有较好杀虫效果，能减少化学农药的用量和使用次数，降低植棉成本，减少农药对农田生态环境的破坏[6]，具有较好的社会、经济和生态效益[7]。虽然Bt棉在生产上被大面积应用，但在种植过程中暴露诸多问题，主要表现在2个方面：即抗虫性存在时空差异[8-11]且易受环境影响[12-15]。环境因子中温度是最重要的影响因子之一。在棉花产量形成的关键时期——盛铃期常常出现高温天气，因此研究高温特别是昼夜变温下高温对棉铃Bt杀虫蛋白表达量的影响，对于准确预测Bt棉的抗虫性及时防治棉铃虫具有重要意义。长江中下游地区棉花盛铃期常常受高温气候的影响，白天的温度高达37～40℃，研究昼夜变温下高温对Bt棉铃壳杀虫蛋白表达量及相关的氮代谢生理机制，可为高温逆境下Bt棉的抗虫性安全应用和合理防治棉铃虫提供科学依据。铃壳作为棉铃虫等相关害虫危害棉铃的首食器官，研究其杀虫蛋白含量在高温下的变化是确定棉铃抗虫能力高低的首要依据。前人研究发现高温胁迫能显著降低Bt棉铃壳中杀虫蛋白表达量，且随着温度升高，下降的幅度变大[16-18]。路献勇等[19]研究Bt棉的抗虫性对不同昼夜温差变化的响应机理时发现，白天高温35℃，夜间低温18℃，能显著影响Bt棉杀虫蛋白表达量和幼虫死亡率，且随着胁迫时间的延长，杀虫蛋白含量和幼虫死亡率急剧下降。陈源等[20]研究表明在38℃以上高温时，Bt棉棉蕾中杀虫蛋白表达量显著下降，且随温度升高，杀虫蛋白含量下降幅度增大。周桂生等[21]研究发现同一高温下，胁迫时间越长，棉铃虫取食后的死亡率越低。王永慧等[22]通过研究不同生育期温湿度胁迫及胁迫解除后Bt棉杀虫蛋白表达量的变化发现，温湿度胁迫显著抑制Bt棉杀虫蛋白的表达。张美俊等[23]研究表明，较高温度和适宜土壤含水量有利于Bt蛋白前期快速降解。吕春花[24]研究表明，棉蕾中Bt杀虫蛋白含量在环境温度达38℃以上时急剧下降。陈德华等[25]研究表明，铃期37℃高温胁迫24 h和48 h，会引起棉株叶片中Bt杀虫蛋白含量显著下降。虽然温度对Bt棉杀虫蛋白表达量的影响的研究较多，但都是在温度不变的条件下进行的，而棉花的生长是在昼夜变温的环境下。已有报道表明[26]，在高温胁迫终止后，棉花叶片的Bt蛋白含量都有一定程度的恢复。因此本研究探讨昼夜变温条件下高温对铃壳Bt蛋白表达量影响能更准确反映自然环境下棉铃抗虫能力的变化。

1 试验材料与方法

1.1 试验设计

试验于2011―2012年在扬州大学江苏省栽培生理重点实验室进行。试验采用盆栽种植方式进行。盆钵用土为大田土经自然风干、过筛去杂后的砂质壤土，用水沉实，含有机质1.88%，水解氮 134.7 mg·kg－1、速效磷 22.5 mg·kg－1和速效钾81.3 mg·kg－1， 土壤 N、P、K 含量分别为 108 mg·kg－1、40.5 mg·kg－1和 82.0 mg·kg－1。 盆钵直径 35 cm，高30 cm，每盆装土20 kg。栽培方式为营养钵育苗移栽，定期浇水，保持盆中土壤含水量接近田间持水量。肥料与化控运筹按当地高产栽培技术，按等量均分，单株定量原则施用。

试验以转Bt基因抗虫棉常规种泗抗1号和杂交种泗抗3号 （分别以SK-1和SK-3表示）为材料，两年均于4月6日播种，5月17日移植于盆中。在棉花生长至盛铃期，于人工气候室设计39℃/27℃高温胁迫试验（T），持续时间分别为4 d、7 d和10 d。气候室内相对湿度保持60%～70%。在人工气候室达到预期温湿度，移入棉花样本。同时设对照（CK），温度为32℃/25℃（白天/夜晚）。每处理3盆，重复3次，共9盆。胁迫至预定时间后，取10日龄棉铃，液氮速冻。

1.2 测定项目

1.2.1 Bt蛋白含量的测定。用酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）进行测定，药盒由中国农业大学提供。

1.2.2 可溶性蛋白含量的测定。可溶性蛋白含量测定应用G-250考马斯亮蓝比色法。

1.2.3 游离氨基酸含量的测定。游离氨基酸含量的测定应用抗坏血酸茚三酮染色法进行测定。

1.2.4 谷氨酸丙酮酸转氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase,GPT）活性测定。鲜样在Tris-HCl缓冲液中研磨离心后，提取液用赖氏比色法测定。

1.2.5 蛋白酶活性的测定。运用考马斯亮蓝法、茚三酮和抗坏血酸比色法测定可溶性蛋白质含量、游离氨基酸含量，进而计算蛋白酶和肽酶活性。

表1昼夜变温下高温对铃壳Bt杀虫蛋白表达量对影响Table 1 Effects of high alternating day and night temperature conditions on the Bt protein content in boll wall(ng·g-1)

1.3 数据处理与统计分析方法

用MS Excel 2016软件进行数据的处理和作图，用SPSS 13.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和最小显著差异法（LSD，α＝0.05）比较同一品种不同处理间差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 昼夜变温下高温不同持续期对Bt棉铃壳杀虫蛋白表达量的影响

表1表明，盛铃期昼夜变温条件下高温持续胁迫至4 d时，2个品种铃壳中Bt杀虫蛋白表达量与各自对照相比均无明显变化，但胁迫至7 d时，Bt杀虫蛋白表达量均明显降低，且随着胁迫时间的延长，下降的幅度也越大。其中，2011年常规种SK-1在胁迫至4 d、7 d和10 d时，铃壳中Bt杀虫蛋白表达量分别下降了0.53%、18.44%和39.54%；杂交种SK-3分别下降了2.37%、14.82%和34.67%。2012年常规种SK-1在胁迫至4 d、7 d和10 d时，铃壳中Bt杀虫蛋白表达量分别下降了2.82%、19.07%和44.48%；杂交种SK-3分别下降了2.26%、15.26%和33.23%。方差分析表明，无论是常规种还是杂交种，变温条件下高温胁迫持续至7d时，Bt蛋白表达量显著下降，且随胁迫持续时间的延长，下降速率加快。品种间则表现为常规棉的Bt蛋白表达量下降幅度比杂交棉稍高，说明在昼夜变温下高温胁迫对杂交棉铃壳的抗虫性下降影响比常规棉小。

2.2 昼夜变温下高温不同持续期对Bt棉铃壳的氮代谢生理的影响

2.2.1 对铃壳中游离性氨基酸含量的影响。图1表明，2个棉花品种在昼夜变温条件下高温胁迫至4 d时，铃壳中游离氨基酸含量变化较小；胁迫至7 d时，游离氨基酸含量均明显增加。随着胁迫时长的增加，增长幅度均增加。其中，SK-1在胁迫至4 d、7 d和10 d时，游离氨基酸含量比0 d分别上升 2.59%、36.33%和 90.26%；SK-3分别上升4.30%、18.61%和59.26%。品种间表现为常规种铃壳中游离氨基酸含量上升幅度比杂交种稍高。

2.2.2 对铃壳中可溶性蛋白含量的影响。由图2可知，昼夜变温条件下高温胁迫至4 d时，铃壳中的可溶性蛋白含量下降较小；胁迫至7 d，下降速度明显加快，下降幅度增大。SK-1在昼夜变温持续胁迫4 d、7 d、10 d条件下，铃壳中的可溶性蛋白含量分别下降了0.67%、24.14%和 50.39%；SK-3分别下降了0.21%、17.71%、38.47%。品种间表现为常规种铃壳中的可溶性蛋白含量下降幅度高于杂交种。

由图2可知，昼夜变温条件下高温胁迫至4 d时，铃壳中的可溶性蛋白含量下降较小；胁迫至7 d，下降速度明显加快，下降幅度增大。SK-1在昼夜变温持续胁迫4 d、7 d、10 d条件下，铃壳中的可溶性蛋白含量比0 d时分别下降了0.67%、24.14%和 50.39%；SK-3分别下降了 0.21%、17.71%、38.47%。品种间表现为常规种铃壳中的可溶性蛋白含量下降幅度高于杂交种。

2.2.3 对铃壳中GPT活性的影响。由图3可知，2个不同类型品种在昼夜变温下高温持续胁迫至7 d时，GPT活性均明显下降，且随着胁迫时间的延长，下降幅度增加。其中，SK-1在胁迫至4 d、7 d和10 d时，GPT活性比0 d时分别下降了3.34%、18.06%和42.40%；SK-3比0 d时分别下降了0.50%、15.11%和36.81%。品种间表现为杂交种的GPT活性下降幅度稍低于常规种。

图1昼夜变温下高温对棉铃壳中游离性氨基酸含量的影响Fig.1 Effects of high alternating day and nighttemperature conditions on the free am ino acid content in boll wall

图2昼夜变温下高温对棉铃壳中可溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effects of high alternating day and night temperature conditions on the soluble protein content in the boll wall

图3昼夜变温下高温对棉铃壳中GTP活性的影响Fig.3 Effects of high alternating day and night temperature conditions on GPT activity in the boll wall

2.2.4 对铃壳中蛋白酶活性的影响。图4表明，盛铃期2个品种在昼夜变温条件下高温胁迫至4 d时，棉铃壳中蛋白酶活性变化较小，胁迫至7 d时，蛋白酶活性明显增加，随着胁迫时长的增加，增长幅度均增加。常规种在变温胁迫至4 d、7 d、10 d时，铃壳中蛋白酶活性与0 d时相比，分别上升了0.79%、44.73%和95.11%；杂交种铃壳中蛋白酶活性与0 d时相比，则分别上升了0.29%、27.64%和78.54%。在胁迫时长为7 d以上时，铃壳中的蛋白酶活性增加速度明显加快，且胁迫时间越长，增长幅度越大。杂交种SK-3铃壳中蛋白酶活性表现相似。

图4昼夜变温下高温对棉铃壳中蛋白酶活性的影响Fig.4 Effects of high alternating day and night temperature conditions on protease activity in the boll wall

3 讨论

3.1 昼夜变温下高温引起Bt棉铃壳杀虫蛋白显著下降的时间明显推迟

关于温度对Bt棉抗虫性表达影响的研究有许多，但大都是以持续高温为处理。马爱丽等[27]研究发现，在盛蕾期和盛铃期36℃以上的高温持续胁迫24 h，杀虫蛋白表达量急剧下降。吕春花[24]等研究发现在高温持续胁迫条件下Bt杀虫蛋白含量在3 d内下降幅度较大。衡丽等[28]研究结果表明，39℃高温持续胁迫7 d，铃壳中Bt蛋白含量呈持续下降特征，持续胁迫3 d内尤其是在1 d内下降幅度最大。

本试验白天高温、夜晚温度胁迫解除的高温持续胁迫结果进一步表明，盛铃期铃壳中杀虫蛋白表达量同样随着胁迫时间的延长而下降。但无论是常规种还是杂交种，在持续胁迫4 d内，铃壳中Bt杀虫蛋白表达量与相应对照相比均下降较小，且无显著差异；在持续胁迫7 d以上时，铃壳中Bt杀虫蛋白表达量显著下降。说明昼夜变温下高温持续胁迫需要更长的时间才会引起铃壳抗虫性的显著降低。在棉花实际生产中，由于有昼夜温度变化，高温影响实际上是1种变温胁迫，因而本试验结果更能反映大田环境下棉铃抗虫性的变化。因此，Bt棉花的生产则更应注意持续7 d以上的高温，应及时采取措施应对棉铃虫的防治策略。

3.2 昼夜变温下高温持续胁迫同样会引起铃壳中Bt蛋白合成下降，分解加剧，从而导致抗虫性下降

高温胁迫对Bt棉杀虫蛋白表达量的影响机理已经有了较多的研究。陈德华等[29-30]认为其与氮代谢密切相关。本研究进一步表明，昼夜变温下高温影响Bt棉铃壳杀虫蛋白浓度下降与氮代谢生理密切相关。在昼夜变温下高温胁迫7 d以上时，铃壳中Bt蛋白含量下降的同时，游离性氨基酸含量和蛋白酶活性明显上升，可溶性蛋白含量和GPT活性则显著下降。相关分析进一步表明，昼夜变温不同持续期胁迫处理下，铃壳中可溶性白含量、GPT活性与Bt杀虫蛋白含量之间呈极显著的正相关关系(相关系数分别为0.954**、0.988**)；而游离氨基酸含量、蛋白酶活性与Bt杀虫蛋白含量呈极显著负相关关系 (相关系数分别为－0.924**、－0.775**)。因此，昼夜变温下高温胁迫7 d以上时会引起铃壳中Bt蛋白的分解加强，合成减弱，从而导致Bt蛋白表达量下降。

4 结论

在昼夜变温（39/27℃）下高温胁迫下，铃壳中Bt杀虫蛋白随胁迫时间的延长而降低，7 d后铃壳中Bt杀虫蛋白急剧下降，常规种泗抗1号和杂交种泗抗3号分别下降了19%左右和15%左右。在铃壳中Bt杀虫蛋白下降同时，游离性氨基酸含量和蛋白酶活性明显上升，可溶性蛋白含量和GPT活性则显著下降。这说明昼夜变温下的高温胁迫会导致Bt棉蛋白质合成减弱，分解加剧，从而引起抗虫性下降。

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